Tankewol foar jo besite oan Nature.com. De ferzje fan 'e browser dy't jo brûke hat beheinde CSS-stipe. Foar de bêste resultaten riede wy oan dat jo in nijere ferzje fan jo browser brûke (of de kompatibiliteitsmodus yn Internet Explorer útskeakelje). Yn 'e tuskentiid, om trochgeande stipe te garandearjen, litte wy de side sûnder styling of JavaScript sjen.
De ûntdekking en it foardielige gebrûk fan natuerlike produkten kin helpe om it minsklik libben te ferbetterjen. Gemikaliën dy't plantgroei remme wurde breed brûkt as herbiciden om ûnkrûd te bestriden. Fanwegen de needsaak om ferskate soarten herbiciden te brûken, is d'r in needsaak om ferbiningen te identifisearjen mei nije wurkingsmeganismen. Yn dizze stúdzje hawwe wy in nije N-alkoxypyrroolferbining, coumamonamide, ûntdutsen fan Streptomyces werraensis MK493-CF1 en it folsleine syntezeproses fêststeld. Troch biologyske aktiviteitstests hawwe wy ûntdutsen dat urs-monoamsoer in syntetyske tuskenstof is fan urs-monoamide en in potinsjele ...plantgroeiremmerDerneist hawwe wy ferskate urbenonzuurderivaten ûntwikkele, ynklusyf it urbenyloxyderivaat (UDA), dat in hege herbicide aktiviteit hat sûnder de groei fan HeLa-sellen negatyf te beynfloedzjen. Wy hawwe ek fûn dat urmotonzuurderivaten plantmikrotubuli fersteure; derneist beynfloedet KAND aktinefilamenten en feroarsaket seldea; Dizze mearfâldige effekten ferskille fan dy fan bekende mikrotubuli-ynhibitoren en suggerearje in nij wurkingsmeganisme foar ursonzuur, wat in wichtich foardiel is yn 'e ûntwikkeling fan nije herbiziden.
De ûntdekking en praktyske tapassing fan foardielige natuerlike produkten en harren derivaten is in middel om de kwaliteit fan it minsklik libben te ferbetterjen. Sekundêre metaboliten produsearre troch mikroorganismen, planten en ynsekten hawwe laat ta grutte foarútgong yn medisinen en lânbou. In protte antibiotika en anty-leukemy-medisinen binne ûntwikkele út natuerlike produkten. Derneist binne ferskate soarten fanbestridingsmiddels, fungiciden en herbiciden wurde út dizze natuerlike produkten helle foar gebrûk yn 'e lânbou. Benammen ûnkrûdbestridingsherbiciden binne wichtige ark foar it ferheegjen fan gewaaksopbringsten yn 'e moderne lânbou, en ferskate soarten ferbiningen wurde al kommersjeel brûkt. Ferskate sellulêre prosessen yn planten, lykas fotosynteze, aminosoermetabolisme, selwandsynteze, regeling fan mitose, fytohormoansignalisaasje, of proteïnesynteze, wurde beskôge as typyske doelen fan herbiciden. Ferbiningen dy't de mikrotubulusfunksje remme binne in mienskiplike klasse herbiciden dy't plantgroei beynfloedzje troch ynfloed te hawwen op mitoatyske regeling2.
Mikrotubuli binne ûnderdielen fan it cytoskelet en binne breed bewarre bleaun yn eukaryote sellen. De tubuline-heterodimeer bestiet út α-tubuline en β-tubuline en foarmje lineêre mikrotubuli-protofilamenten, mei 13 protofilamenten dy't in silindryske struktuer foarmje. Mikrotubuli spylje meardere rollen yn plantesellen, ynklusyf it bepalen fan selfoarm, seldieling en yntrasellulêr transport3,4. Plantesellen befetsje mikrotubuli ûnder it ynterfase-plasmamembraan, en dizze saneamde kortikale mikrotubuli wurde tocht de organisaasje fan cellulose-mikrofibrillen te kontrolearjen troch de regeling fan cellulosesynthase-kompleksen4,5. Kortikale mikrotubuli fan woartelepidermale sellen, oanwêzich yn 'e sône fan rappe ferlinging fan' e woartelpunt, lizze lateraal, en cellulose-mikrofibers folgje dizze mikrotubuli en beheine de rjochting fan selútwreiding, wêrtroch anisotropyske selferlinging befoardere wurdt. Dêrom is de mikrotubuli-funksje nau besibbe oan plantmorfology. Aminosoersubstituasjes yn genen dy't kodearje foar tubuline feroarsaakje skew fan kortikale mikrotubuli-arrays en lofts- of rjochtssidige groei yn Arabidopsis 6,7. Op deselde wize kinne mutaasjes yn mikrotubuli-assosjeare proteïnen dy't mikrotubuli-dynamyk regelje, ek liede ta ferfoarme woartelgroei 8,9,10,11,12,13. Derneist feroarsaket behanneling mei mikrotubuli-fersteurende herbiciden lykas disopyramide, ek wol bekend as pretilachlor, ek loftssidige skeane woartelgroei 14. Dizze gegevens jouwe oan dat krekte regeling fan mikrotubuli-funksje kritysk is foar it bepalen fan 'e rjochting fan plantgroei.
Ferskate soarten mikrotubuli-ynhibitoren binne ûntdutsen, en dizze medisinen hawwe wichtige bydragen levere oan cytoskeletûndersyk, lykas oan lânbou en medisinen2. Benammen oryzaline, dinitroanilineferbiningen, disopyramide, benzamide-relatearre ferbiningen, en har analogen kinne de mikrotubulifunksje remme en dêrmei de groei fan planten remme. Dêrom wurde se in soad brûkt as herbiziden. Om't mikrotubuli lykwols in wichtige komponint binne fan plant- en diersellen, binne de measte mikrotubuli-ynhibitoren cytotoksis foar beide seltypen. Dêrom, nettsjinsteande har erkende nut as herbiziden, wurdt in beheind oantal antimikrotubuli-aginten brûkt foar praktyske doelen.
Streptomyces is in skaai fan 'e famylje Streptomyces, dy't aerobe, gram-positive, filamenteuze baktearjes omfettet en breed bekend is om syn fermogen om in breed skala oan sekundêre metaboliten te produsearjen. Dêrom wurdt it beskôge as ien fan 'e wichtichste boarnen fan nije biologysk aktive natuerlike produkten. Yn 'e hjoeddeiske stúdzje hawwe wy in nije ferbining ûntdutsen mei de namme coumamonamide, dy't isolearre waard út Streptomyces werraensis MK493-CF1 en S. werraensis ISP 5486. Mei help fan spektrale analyze en folsleine spektrale analyze waard de struktuer fan coumamonamide karakterisearre en waard syn unike N-alkoxypyrroolskelet bepaald. synteze. Ursmonsoer, in syntetyske tuskenstof fan ursmonoamide en syn derivaten, die bliken de groei en kimen fan 'e populêre modelplant Arabidopsis thaliana te remjen. Yn in struktuer-aktiviteitsrelaasjestúdzje hawwe wy fûn dat in ferbining mei C9 modifisearre ta ursonsoer, neamd nonyloxyderivaat fan ursonsoer (KAND), it remmende effekt op groei en kimen signifikant fersterket. It is opmerklik dat de nij ûntdutsen plantegroei-remmer ek ynfloed hie op 'e groei fan tabak en levermos en net cytotoksik wie foar baktearjes of HeLa-sellen. Boppedat feroarsaakje guon urmotonzuurderivaten in ferfoarme woartelfenotype, wat ymplisearret dat dizze derivaten direkt of yndirekt ynfloed hawwe op mikrotubuli. Yn oerienstimming mei dit idee jouwe ús waarnimmings fan mikrotubuli dy't immunohistochemysk of mei fluorescerende proteïnen markearre binne oan dat KAND-behanneling mikrotubuli depolymerisearret. Derneist fersteurde behanneling mei kumamotonzuurderivaten aktine-mikrofilamenten. Sa hawwe wy in nije plantegroei-remmer ûntdutsen waans unike wurkingsmeganisme de ferneatiging fan it cytoskelet omfettet.
Stam MK493-CF1 waard isolearre út boaiem yn Shinagawa-ku, Tokio. Stam MK493-CF1 foarme goed fertakke stromale mycelium. De parsjele sekwinsje fan it 16S ribosomale RNA-gen (1422 bp) waard bepaald. Dizze stam is tige ferlykber mei S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: typyske stam, 99,93%). Op basis fan dit resultaat waard bepaald dat dizze stam nau besibbe wie oan de type stam fan S. werraensis. Dêrom hawwe wy dizze stam tydlik S. werraensis MK493-CF1 neamd. S. werraensis ISP 5486T produseart ek deselde bioaktive ferbiningen. Om't der yn it begjin net folle ûndersyk dien wie nei it krijen fan natuerlike produkten út dit mikro-organisme, waard fierder gemysk ûndersyk útfierd. Nei it kultivearjen fan S. werraensis MK493-CF1 op gerstmedium troch fêste-steatfermentaasje by 30 °C foar 14 dagen, waard it medium ekstrahearre mei 50% EtOH. 60 ml fan it monster waard droege om 59,5 mg rûch ekstrakt te krijen. It rûge ekstrakt waard ûnderwurpen oan omkearde faze HPLC om N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide (1, neamd coumamonamide, 36,0 mg) te jaan. De totale hoemannichte fan 1 is sawat 60% fan it rûge ekstrakt. Dêrom hawwe wy besletten om de eigenskippen fan kumamotoamide 1 yn detail te bestudearjen.
Coumamonamide 1 is in wyt amorf poeier en hege resolúsje massaspektrometry (HRESIMS) befêstiget C6H8N2O2 (Fig. 1). It C2-substituearre pyrroolfragment fan dizze ferbining wurdt karakterisearre troch δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH yn 1H NMR-spektrum: 4.5 Hz, H-5) en δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6), en it 13C NMR-spektrum lit de oanwêzigens fan fjouwer sp2 koalstofatomen sjen. De oanwêzigens fan in amidegroep op 'e C2-posysje waard beoardiele troch HMBC-korrelaasje fan it C-3-proton nei de amidekarbonylkoalstof by δC 161.1. Derneist jouwe 1H- en 13C-NMR-pieken by δH 4.10 (3H, S) en δC 68.3 de oanwêzigens fan N-metoksygroepen yn it molekule oan. Hoewol de juste posysje fan 'e metoksygroep noch net bepaald wie mei spektroskopyske analyze lykas ferbettere ferskilspektroskopie en nukleêre Overhauser-ôfkoarting (NOEDF), waard N-metoksy-1H-pyrrol-2-karboksamide de earste kandidaatferbining.
Om de juste struktuer fan 1 te bepalen, waard in totale synteze útfierd (Fig. 2a). Behanneling fan kommersjeel beskikbere 2-aminopyridine 2 mei m-CPBA resultearre yn it oerienkommende N-okside 3 yn kwantitative opbringst. Nei de 2-aminoazidaasje fan 2 waard de syklokondensaasjereaksje beskreaun troch Abramovich útfierd yn benzeen by 90 °C om de winske 1-hydroxy-1H-pyrrool-2-karbonitril 5 yn gram te krijen. Snelheid 60% (twa stadia). 15,16. Methylaasje en hydrolyse fan 4 joech doe 1-metoksy-1H-pyrrool-2-karboksylsoer (neamd "kumotonsoer", 6) yn goede opbringst (70%, twa stappen). Uteinlik joech amidaasje fia soerchloride-tuskenprodukt 6 mei wetterige ammoniak Kumamoto-amide 1 yn 98% opbringst. Alle spektrale gegevens fan synthetisearre 1 wiene fergelykber mei isolearre 1, sadat de struktuer fan 1 bepaald waard;
Algemiene synteze en analyze fan 'e biologyske aktiviteit fan urbenamide en urbeensoer. (a) Totale synteze fan Kumamoto-amide. (b) Sân dagen âlde wildtype Arabidopsis Columbia (Col) siedlingen waarden groeid op Murashige en Skoog (MS) platen mei coumamonamide 6 of coumamonamide 1 yn 'e oanjûne konsintraasjes. Skaalbalke = 1 sm.
Earst hawwe wy de biologyske aktiviteiten fan urbenamide en syn tuskenprodukten beoardiele op harren fermogen om plantgroei te modulearjen. Wy hawwe ferskate konsintraasjes fan ursmonamide 1 of ursmonsoer 6 tafoege oan MS-agarmedium en Arabidopsis thaliana-siedlings op dit medium kultivearre. Dizze assays lieten sjen dat hege konsintraasjes (500 μM) fan 6 woartelgroei remden (Fig. 2b). Dêrnei hawwe wy ferskate derivaten generearre troch de N1-posysje fan 6 te ferfangen en hawwe wy struktuer-aktiviteitsrelaasjestúdzjes op har útfierd (it analoge syntezeproses wurdt beskreaun yn 'e Supporting Information (SI)). Arabidopsis-siedlings waarden groeid op in medium mei 50 μM ursonsoerderivaten, en de woartellingte waard metten, lykas te sjen is op 'e ôfbylding. Lykas te sjen is yn figueren 3a, b en S1, hawwe coumamosoeren ferskillende lingten fan lineêre alkoxyketens (9, 10, 11, 12 en 13) of grutte alkoxyketens (15, 16 en 17) op 'e N1-posysje. De derivaten lieten wichtige remming fan woartelgroei sjen. Derneist hawwe wy fûn dat tapassing fan 200 μM 10, 11, of 17 de kimen remde (Figs. 3c en S2).
Undersyk nei de struktuer-aktiviteitsrelaasje fan Kumamoto-amide en besibbe ferbiningen. (a) Struktuer- en syntezeskema fan analogen. (b) Kwantifikaasje fan woartellingte fan 7 dagen âlde siedlingen groeid op MS-medium mei of sûnder 50 μM coumamonamide-derivaten. Asterisken jouwe wichtige ferskillen oan mei sham-behanneling (t-test, p< 0,05). n>18. Gegevens wurde werjûn as gemiddelde ± SD. nt betsjut "net hifke" om't mear as 50% fan 'e siedden net ûntkiemd binne. (c) Kwantifikaasje fan it ûntkiemingspersintaazje fan behannele siedden dy't 7 dagen ynkubearre binne yn MS-medium mei of sûnder 200 μM coumamonamide en relatearre ferbiningen. Asterisken jouwe wichtige ferskillen oan mei sham-behanneling (chi-kwadraattest). n=96.
Nijsgjirrich is dat de tafoeging fan alkyl-sydketens langer as C9 de remmende aktiviteit fermindere, wat suggerearret dat kumamotoïsoer-relatearre ferbiningen sydketens fan in bepaalde grutte nedich binne om har biologyske aktiviteit te fertoanen.
Omdat struktuer-aktiviteitsrelaasje-analyze oantoande dat C9 modifisearre wie ta ursonsoer en it nonyloxyderivaat fan ursonsoer (hjirnei oantsjutten as KAND 11) de meast effektive plantegroeiremmer wie, hawwe wy in detaillearre karakterisaasje fan KAND 11 útfierd. Behanneling fan Arabidopsis mei 50 μM KAND 11 foarkaam hast folslein kimen, wylst legere konsintraasjes (40, 30, 20, of 10 μM) fan KAND 11 woartelgroei op in dosisôfhinklike manier remden (Fig. 4a, b). Om te testen oft KAND 11 de leefberens fan it woartelmeristeem beynfloedet, hawwe wy woartelmeristemen ûndersocht dy't kleurd wiene mei propidiumjodide (PI) en de grutte fan it meristeemgebiet metten. De grutte fan it meristeem fan siedlingen groeid op in medium mei 25 μM KAND-11 wie 151,1 ± 32,5 μm, wylst de grutte fan it meristeem fan siedlingen groeid op in kontrôlemedium mei DMSO 264,7 ± 30,8 μm wie (Fig. 4c, d), wat oanjout dat KAND-11 sellulêre aktiviteit herstelt. Woartelmeristeem. Yn oerienstimming hjirmei fermindere KAND 11-behanneling de hoemannichte selsdielingsmarker CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS-sinjaal yn it woartelmeristeem (Fig. 4e) 17. Dizze resultaten jouwe oan dat KAND 11 woartelgroei remt troch selproliferaasjeaktiviteit te ferminderjen.
Analyse fan it remmende effekt fan urbenonzuurderivaten (urbenyloxyderivaten) op groei. (a) 7 dagen âlde wylde-type Col-siedlings groeid op MS-platen mei de oanjûne konsintraasjes fan KAND 11. Skaalbalke = 1 sm. (b) Kwantifikaasje fan woartellingte. Letters jouwe wichtige ferskillen oan (Tukey HSD-test, p< 0,05). n>16. Gegevens wurde werjûn as gemiddelde ± SD. (c) Konfokale mikroskopie fan propidiumjodide-kleurde wylde-type Col-woartels groeid op MS-platen mei of sûnder 25 μM KAND 11. Wite heakjes jouwe woartelmeristeem oan. Skaalbalke = 100 µm. (d) Kwantifikaasje fan woartelmeristeemgrutte (n = 10 oant 11). Statistyske ferskillen waarden bepaald mei t-test (p< 0,05). De balken fertsjintwurdigje de gemiddelde meristeemgrutte. (e) Differinsjaal ynterferinsjekontrast (DIC) mikroskopie fan in woartelmeristeem mei it CDKB2-konstrukt; 1pro: CDKB2; 1-GUS kleurd en kleurd op 5 dagen âlde siedlingen groeid op MS-platen mei of sûnder 25 µM KAND-assay.
De fytotoksisiteit fan KAND 11 waard fierder hifke mei in oare twazaadlobbige plant, tabak (Nicotiana tabacum), en in wichtich lânplantmodelorganisme, levermos (Marchantia polymorpha). Lykas yn it gefal fan Arabidopsis produsearren tabak SR-1-siedlings dy't groeid waarden op medium mei 25 μM KAND 11 koartere woartels (Fig. 5a). Derneist ûntkiemden 40 fan 48 siedden op platen mei 200 μM KAND 11, wylst alle 48 siedden ûntkiemden op mock-behannele media, wat oanjout dat hegere konsintraasjes fan KAND signifikant wiene (p< 0.05; chi-test -kwadraat) remde de kimen fan tabak. (Fig. 5b). Derneist wie de konsintraasje fan KAND 11 dy't baktearjele groei yn levermos remde, fergelykber mei de effektive konsintraasje yn Arabidopsis (Fig. 5c). Dizze resultaten jouwe oan dat KAND 11 de groei fan in ferskaat oan planten kin remje. Wy hawwe doe de mooglike cytotoxiciteit fan bearemonoamide-relatearre ferbiningen yn oare organismen ûndersocht, nammentlik minsklike HeLa-sellen en Escherichia coli-stam DH5α, as fertsjintwurdigers fan hegere dierlike en baktearjele sellen, respektivelik. Yn in searje selproliferaasje-assays hawwe wy waarnommen dat coumamonamide 1, coumamonamidinezuur 6 en KAND 11 gjin ynfloed hiene op de groei fan HeLa- of E. coli-sellen by konsintraasjes fan 100 μM (Fig. 5d,e).
Groei-ynhibysje fan KAND 11 yn net-Arabidopsis-organismen. (a) Twa wiken âlde wildtype SR-1 tabakssiedlings waarden groeid op fertikaal pleatste MS-platen mei 25 μM KAND 11. (b) Twa wiken âlde wildtype SR-1 tabakssiedlings waarden groeid op horizontaal pleatste MS-platen mei 200 μM KAND 11. (c) Twa wiken âlde wildtype Tak-1 levermosknoppen groeid op Gamborg B5-platen mei de oanjûne konsintraasjes fan KAND 11. Reade pylken jouwe spoaren oan dy't stopten mei groeien binnen de ynkubaasjeperioade fan twa wiken. (d) Selproliferaasje-assay fan HeLa-sellen. It oantal libbene sellen waard metten mei fêste tiidsintervallen mei in selstelkit 8 (Dojindo). As kontrôle waarden HeLa-sellen behannele mei 5 μg/ml aktinomycine D (Act D), dat RNA-polymerase-transkripsje remt en seldea feroarsaket. Analysen waarden yn triplikaat útfierd. (e) E. coli-selproliferaasje-assay. E. coli-groei waard analysearre troch it mjitten fan OD600. As kontrôle waarden sellen behannele mei 50 μg/ml ampicilline (Amp), dat de synteze fan baktearjele selwanden remt. De analyses waarden yn triplikaat útfierd.
Om it wurkingsmeganisme fan cytotoxiciteit feroarsake troch uramide-relatearre ferbiningen te ûntsiferjen, hawwe wy urbeenzuurderivaten mei matige remmende effekten opnij analysearre, lykas te sjen is op 'e ôfbylding. Lykas te sjen is yn figueren 2b, 6a, produsearren siedlings groeid op agarplaten mei hege konsintraasjes (200 μM) urmotonzuur 6 koartere en nei lofts bûgde woartels (θ = - 23,7 ± 6,1), wylst fan siedlings groeid op it kontrôlemedium, de siedlings hast rjochte woartels produsearren (θ = - 3,8 ± 7,1). Dizze karakteristike skeane groei is bekend as it gefolch fan dysfunksje fan kortikale mikrotubuli14,18. Yn oerienstimming mei dizze fynst feroarsaken de mikrotubuli-destabiliserende medisinen disopyramide en oryzalin ferlykbere woartelkanteling ûnder ús groeiomstannichheden (Figs. 2b, 6a). Tagelyk hawwe wy urmotonzuurderivaten testen en ferskate dêrfan selektearre dy't, by bepaalde konsintraasjes, skeane woartelgroei feroarsaken. Ferbiningen 8, 9 en 15 feroaren de rjochting fan woartelgroei by respektivelik 75 μM, 50 μM en 40 μM, wat oanjout dat dizze ferbiningen mikrotubuli effektyf destabilisearje kinne (Fig. 2b, 6a). Wy hawwe ek it machtichste ursolsoerderivaat, KAND 11, testen by in legere konsintraasje (15 μM) en fûnen dat tapassing fan KAND 11 woartelgroei remde en dat de rjochting fan woartelgroei ûngelikense wie, hoewol se nei lofts hellen (Figuer C3). Omdat hegere konsintraasjes fan mikrotubuli-destabiliserende medisinen soms plantgroei remje ynstee fan woartelkanteling te feroarsaakjen, hawwe wy dêrnei de mooglikheid beoardiele dat KAND 11 mikrotubuli beynfloedet troch kortikale mikrotubuli yn woartelepidermale sellen te observearjen. Immunohistochemy mei anti-β-tubuline-antistoffen yn epidermale sellen fan siedlingswoartels behannele mei 25 μM KAND 11 liet it ferdwinen sjen fan hast alle kortikale mikrotubuli yn epidermale sellen yn 'e ferlingingsône (Fig. 6b). Dizze resultaten jouwe oan dat kumamotonzuur en syn derivaten direkt of yndirekt ynwurkje op mikrotubuli om se te fersteuren en dat dizze ferbiningen nije mikrotubuli-ynhibitoren binne.
Ursonsoer en syn derivaten feroarje kortikale mikrotubuli yn Arabidopsis thaliana. (a) Woartelhellingshoek metten yn 'e oanwêzigens fan ferskate urmotonsoerderivaten by de oanjûne konsintraasjes. De effekten fan twa ferbiningen dy't bekend binne om mikrotubuli te remmen: disopyramide en oryzaline waarden ek analysearre. De ynfoegsel lit de standert sjen dy't brûkt wurdt om woartelgroeihoek te mjitten. Asterisken jouwe wichtige ferskillen oan mei sham-behanneling (t-test, p< 0,05). n>19. Skaalbalke = 1 sm. (b) Kortikale mikrotubuli yn epidermale sellen yn 'e ferlingingsône. Mikrotubuli yn wild-type Arabidopsis Col woartels groeid op MS-platen mei of sûnder 25 μM KAND 11 waarden visualisearre troch immunohistochemyske kleuring mei β-tubuline primêre antistoffen en Alexa Fluor-konjugearre sekundêre antistoffen. Skaalbalke = 10 µm. (c) Mitoatyske struktuer fan mikrotubuli yn it woartelmeristeem. Mikrotubuli waarden visualisearre mei immunohistochemyske kleuring. Mitoatyske struktueren, ynklusyf profase-sônes, spindels en fragmoplasten, waarden teld út konfokale ôfbyldings. Pylkjes jouwe mitoatyske mikrotubuli-struktueren oan. Asterisken jouwe wichtige ferskillen oan mei sham-behanneling (t-test, p< 0,05). n>9. Skaalbalke = 50 µm.
Hoewol Ursa it fermogen hat om de mikrotubulusfunksje te fersteuren, wurdt ferwachte dat it wurkingsmeganisme oars is as typyske mikrotubulus-depolymerisearjende aginten. Bygelyks, hegere konsintraasjes fan mikrotubulus-depolymerisearjende aginten lykas disopyramide en oryzaline feroarsaakje anisotropyske útwreiding fan epidermale sellen, wylst KAND 11 dat net docht. Derneist resultearre de mienskiplike tapassing fan KAND 11 en disopyramide yn in kombineare disopyramide-induzearre woartelgroeireaksje en waard KAND 11-induzearre groeiremming waarnommen (Fig. S4). Wy analysearren ek de reaksje fan 'e oergefoelige disopyramide 1-1 (phs1-1) mutant op KAND 11. phs1-1 hat in net-kanonike tubuline kinase puntmutaasje en produseart koartere woartels as it behannele wurdt mei disopyramide9,20. phs1-1 mutant siedlingen groeid op agarmedium mei KAND 11 hiene koartere woartels fergelykber mei dy groeid op disopyramide (fig. S5).
Derneist hawwe wy mitoatyske mikrotubulusstrukturen, lykas profasezones, spindels en fragmoplasten, waarnommen yn it woartelmeristeem fan siedlingen behannele mei KAND 11. Yn oerienstimming mei de waarnimmings foar CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS waard in wichtige ôfname yn it oantal mitoatyske mikrotubuli waarnommen (Fig. .6c).
Om de cytotoxiciteit fan KAND 11 by subsellulêre resolúsje te karakterisearjen, hawwe wy tabak BY-2 suspensjezellen behannele mei KAND 11 en harren reaksje observearre. Wy hawwe earst KAND 11 tafoege oan BY-2-zellen dy't TagRFP-TUA6 ekspressearje, dat fluoreszinsjeel mikrotubuli markearret, om it effekt fan KAND 11 op kortikale mikrotubuli te beoardieljen. Kortikale mikrotubuli-tichtens waard beoardiele mei ôfbyldingsanalyse, dy't it persintaazje cytoskeletale piksels ûnder cytoplasmatyske piksels kwantifisearre. De assayresultaten lieten sjen dat nei behanneling mei 50 μM of 100 μM KAND 11 foar 1 oere, de tichtens signifikant ôfnaam nei respektivelik 0,94 ± 0,74% of 0,23 ± 0,28%, wylst de tichtens fan sellen behannele mei DMSO 1,61 ± 0,34% bedroech (Fig. 7a). Dizze resultaten binne yn oerienstimming mei de observaasje yn Arabidopsis dat KAND 11-behanneling depolymerisaasje fan kortikale mikrotubuli ynducearret (Fig. 6b). Wy hawwe ek de BY-2-line ûndersocht mei GFP-ABD-labelde aktinefilamenten nei behanneling mei deselde konsintraasje fan KAND 11 en observearre dat KAND 11-behanneling de aktinefilamenten fersteurde. Behanneling mei 50 μM of 100 μM KAND 11 foar 1 oere fermindere de tichtens fan aktinefilamenten signifikant nei respektivelik 1,20 ± 0,62% of 0,61 ± 0,26%, wylst de tichtens yn DMSO-behannele sellen 1,69 ± 0,51% wie (Fig. 2). 7b). Dizze resultaten steane yn kontrast mei de effekten fan propyzamide, dat gjin ynfloed hat op aktinefilamenten, en latrunculin B, in aktine-depolymerisator dy't gjin ynfloed hat op mikrotubuli (SI Figuer S6). Derneist hie behanneling mei coumamonamide 1, coumamonamide soer 6, of KAND 11 gjin ynfloed op mikrotubuli yn HeLa-sellen (SI Figuer S7). Sa wurdt leaud dat it wurkingsmeganisme fan KAND 11 oars is as dat fan bekende cytoskeletfersteurers. Derneist liet ús mikroskopyske observaasje fan BY-2-sellen behannele mei KAND 11 it begjin fan seldea sjen tidens KAND 11-behanneling en liet sjen dat it oanpart fan Evans blau-kleurde deade sellen net signifikant tanommen is nei 30 minuten KAND 11-behanneling, wylst nei 90 minuten behanneling mei 50 μM of 100 μM KAND it oantal deade sellen tanommen is nei respektivelik 43,7% of 80,1% (Fig. 7c). Byinoar nommen jouwe dizze gegevens oan dat it nije ursolsoer-derivaat KAND 11 in plantspesifike cytoskelet-remmer is mei in earder ûnbekend wurkingsmeganisme.
KAND beynfloedet kortikale mikrotubuli, aktinefilamenten en de leefberens fan tabak BY-2-sellen. (a) Fisualisaasje fan kortikale mikrotubuli yn BY-2-sellen yn 'e oanwêzigens fan TagRFP-TUA6. BY-2-sellen behannele mei KAND 11 (50 μM of 100 μM) of DMSO waarden ûndersocht troch konfokale mikroskopie. Kortikale mikrotubule-tichtens waard berekkene út mikrografyen fan 25 ûnôfhinklike sellen. Letters jouwe wichtige ferskillen oan (Tukey HSD-test, p< 0,05). Skaalbalke = 10 µm. (b) Kortikale aktinefilamenten yn BY-2-sellen visualisearre yn 'e oanwêzigens fan GFP-ABD2. BY-2-sellen behannele mei KAND 11 (50 μM of 100 μM) of DMSO waarden ûndersocht troch konfokale mikroskopie. De tichtens fan kortikale aktinefilamenten waard berekkene út mikroskopyen fan 25 ûnôfhinklike sellen. Letters jouwe wichtige ferskillen oan (Tukey HSD-test, p< 0,05). Skaalbalke = 10 µm. (c) Waarnimming fan deade BY-2-sellen troch Evans blauwe kleuring. BY-2-sellen behannele mei KAND 11 (50 μM of 100 μM) of DMSO waarden ûndersocht troch helderfjildmikroskopie. n=3. Skaalbalke = 100 µm.
De ûntdekking en tapassing fan nije natuerlike produkten hat laat ta wichtige foarútgong yn ferskate aspekten fan it minsklik libben, ynklusyf medisinen en lânbou. Histoarysk ûndersyk is útfierd om nuttige ferbiningen út natuerlike boarnen te krijen. Benammen aktinomyceten binne bekend as nuttich as antiparasitêre antibiotika foar nematoden fanwegen har fermogen om ferskate sekundêre metabolisten te produsearjen lykas avermectine, de haadferbining fan ivermectine en bleomycine en syn derivaten, medisinaal brûkt as in antykankermiddel21,22. Likegoed binne in ferskaat oan herbicide ferbiningen ûntdutsen út aktinomyceten, wêrfan guon al kommersjeel brûkt wurde1,23. Dêrom wurdt de analyze fan aktinomycete-metabolisten om natuerlike produkten mei winske biologyske aktiviteiten te isolearjen beskôge as in effektive strategy. Yn dizze stúdzje hawwe wy in nije ferbining, coumamonamide, ûntdutsen út S. werraensis en it mei súkses synthetisearre. Ursonsoer is in syntetyske tuskenstof fan urbenamide en syn derivaten. It kin karakteristike woartelkrul feroarsaakje, matige oant sterke herbicide aktiviteit sjen litte, en direkt of yndirekt plantmikrotubuli beskeadigje. It wurkingsmeganisme fan urmotonsoer kin lykwols ferskille fan dat fan besteande mikrotubuli-ynhibitoren, om't KAND 11 ek aktinefilamenten fersteurt en seldea feroarsaket, wat suggerearret in regeljouwingsmeganisme wêrmei't urmotonsoer en syn derivaten in breed skala oan cytoskeletale struktueren beynfloedzje.
Fierdere detaillearre karakterisaasje fan urbenonzuur sil helpe om it wurkingsmeganisme fan urbenonzuur better te begripen. Yn it bysûnder is it folgjende doel om it fermogen fan ursonzuur te evaluearjen om te binen oan redusearre mikrotubuli om te bepalen oft ursonzuur en syn derivaten direkt op mikrotubuli ynwurkje en se depolymerisearje, of oft har aksje resulteart yn destabilisaasje fan mikrotubuli. Derneist, yn it gefal wêr't mikrotubuli gjin direkt doelwyt binne, sil it identifisearjen fan 'e wurkingsplak en molekulêre doelen fan ursonzuur op plantsellen helpe om de eigenskippen fan besibbe ferbiningen en mooglike manieren om herbicide aktiviteit te ferbetterjen fierder te begripen. Us bioaktiviteitstest liet it unike cytotoksyske fermogen fan ursonzuur sjen op 'e groei fan planten lykas Arabidopsis thaliana, tabak en levermos, wylst noch E. coli noch HeLa-sellen beynfloede waarden. Lytse of gjin toksisiteit foar diersellen is in foardiel fan ursonzuurderivaten as se ûntwikkele wurde as herbiciden foar gebrûk yn iepen lânboufjilden. Yndied, om't mikrotubuli gewoane struktueren binne yn eukaryoten, is har selektive ynhibysje yn planten in wichtige eask foar herbiciden. Bygelyks, propyzamide, in mikrotubuli-depolymerisearjend middel dat direkt oan tubuline bindt en polymerisaasje remt, wurdt brûkt as herbicide fanwegen syn lege toksisiteit foar dierzellen24. Yn tsjinstelling ta disopyramide hawwe besibbe benzamiden ferskillende doelspesifisiteiten. Neist plantmikrotubuli remt RH-4032 of benzoxamide ek mikrotubuli fan dierzellen of oomyceten, respektivelik, en zalilamide wurdt brûkt as fungicide fanwegen syn lege fytotoksisiteit25,26,27. De nij ûntdutsen bear en syn derivaten litte selektive cytotoksisiteit sjen tsjin planten, mar it is it neamen wurdich dat fierdere modifikaasjes har doelspesifisiteit kinne feroarje, wêrtroch potinsjeel ekstra derivaten kinne wurde levere foar de kontrôle fan patogene skimmels of oomyceten.
De unike eigenskippen fan urbenonzuur en syn derivaten binne nuttich foar har ûntwikkeling as herbiciden en gebrûk as ûndersyksynstruminten. It belang fan it cytoskelet by it kontrolearjen fan de foarm fan plantsellen wurdt breed erkend. Eardere stúdzjes hawwe oantoand dat planten komplekse meganismen fan kortikale mikrotubuli-organisaasje ûntwikkele hawwe troch mikrotubuli-dynamika te kontrolearjen om morfogenese goed te kontrolearjen. In grut oantal molekulen dy't ferantwurdlik binne foar de regeling fan mikrotubuli-aktiviteit binne identifisearre, en relatearre ûndersyk is noch oan 'e gong3,4,28. Us hjoeddeistige begryp fan mikrotubuli-dynamika yn plantsellen ferklearret de meganismen fan kortikale mikrotubuli-organisaasje net folslein. Bygelyks, hoewol sawol disopyramide as oryzaline mikrotubuli kinne depolymerisearje, feroarsaket disopyramide slimme woartelferfoarming, wylst oryzaline in relatyf mild effekt hat. Boppedat feroarsaakje mutaasjes yn tubuline, dat mikrotubuli stabilisearret, ek dextrorotaasje yn woartels, wylst paclitaxel, dat ek mikrotubuli-dynamika stabilisearret, dat net docht. Dêrom moat it bestudearjen en identifisearjen fan 'e molekulêre doelen fan ursolzuur nije ynsichten jaan yn' e regeling fan plantkortikale mikrotubuli. Likegoed sille takomstige fergelikingen fan gemikaliën dy't effektyf binne yn it befoarderjen fan ferfoarme groei, lykas disopyramide, en minder effektive gemikaliën, lykas oryzalin of kumamotorsoer, oanwizings jaan oer hoe't ferfoarme groei plakfynt.
Oan 'e oare kant binne ferdigeningsrelatearre cytoskelet-omrangskikkingen in oare mooglikheid om de cytotoxiciteit fan ursonsoer te ferklearjen. Ynfeksje fan in patogeen of ynfiering fan in elicitor yn plantesellen feroarsaket soms ferneatiging fan it cytoskelet en dêrnei seldea29. Bygelyks, oomyceet-ôflaat kryptoksantine is rapportearre om mikrotubuli en aktinefilamenten te fersteuren foarôfgeand oan tabaksseldea, fergelykber mei wat der bart mei KAND-behanneling30,31. De oerienkomsten tusken ferdigeningsreaksjes en sellulêre reaksjes feroarsake troch ursonsoer liede ús ta de hypoteze dat se mienskiplike sellulêre prosessen triggerje, hoewol in rapper en sterker effekt fan ursonsoer as kryptoksantine dúdlik is. Undersyk hat lykwols oantoand dat fersteuring fan aktinefilamenten spontane seldea befoarderet, wat net altyd begelaat wurdt troch mikrotubulusfersteuring29. Derneist bliuwt it te sjen oft de patogeen of elicitor ferfoarme woartelgroei feroarsaket, lykas ursonsoerderivaten dogge. Sa is molekulêre kennis dy't ferdigeningsreaksjes en it cytoskelet ferbynt in oantreklik probleem om oan te pakken. Troch gebrûk te meitsjen fan 'e oanwêzigens fan ferbiningen mei leech molekulêr gewicht dy't besibbe binne oan ursonsoer, lykas in ferskaat oan derivaten mei ferskillende potinsjes, kinne se kânsen biede om ûnbekende sellulêre meganismen te rjochtsjen.
Mei-inoar nommen sil de ûntdekking en tapassing fan nije ferbiningen dy't de dynamyk fan mikrotubuli modulearje krêftige metoaden leverje om de komplekse molekulêre meganismen oan te pakken dy't ûnderlizze oan it bepalen fan 'e foarm fan plantsellen. Yn dizze kontekst kin de koartlyn ûntwikkele ferbining urmotonzuur, dy't ynfloed hat op mikrotubuli en aktinefilamenten en seldea feroarsaket, in kâns biede om de ferbining tusken mikrotubuli-kontrôle en dizze oare meganismen te ûntsiferjen. Sa sil gemyske en biologyske analyze mei urbenonzuur ús helpe om de molekulêre regeljouwingsmeganismen te begripen dy't it cytoskelet fan planten kontrolearje.
Ynokulearje S. werraensis MK493-CF1 yn in 500 mL baffled Erlenmeyer-kolf mei 110 mL siedmedium besteande út 2% (w/v) galaktose, 2% (w/v) essinsjepasta, 1% (w/v) Bacto-komposysje. -sojaton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5% (w/v) maisekstrakt (KOGOSTCH Co., Ltd., Japan), 0,2% (w/v) (NH4)2SO4 en 0,2% CaCO3 yn deionisearre wetter. (pH 7,4 foar sterilisaasje). De siedkulturen waarden 2 dagen by 27 °C ynkubearre op in rotearjende skodder (180 rpm). Produksjekultivaasje fia fêste-steatfermentaasje. De siedkultuer (7 ml) waard oerbrocht nei in 500 ml K-1-flesse mei 40 g produksjemedium besteande út 15 g parse gerst (MUSO Co., Ltd., Japan) en 25 g deionisearre wetter (pH net oanpast foar sterilisaasje). Fermentaasje waard 14 dagen útfierd by 30 °C yn it tsjuster. It fermentaasjemateriaal waard ekstrahearre mei 40 ml EtOH per flesse en sintrifugearre (1500 g, 4 °C, 10 min). De kultuersupernatant (60 ml) waard ekstrahearre mei in mingsel fan 10% MeOH/EtOAc. De organyske laach waard ûnder ferlege druk ferdampt om in residu (59,5 mg) te krijen, dat ûnderwurpen waard oan HPLC mei gradiënteluasje (0–10 minuten: 90%) op in omkearde fazekolom (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × lingte 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 minuten: 90% H2O/CH3CN oant 70% H2O/CH3CN (gradiënt), 35–45 minuten: 90% H2O/EtOH, 45–155 minuten: 90% H2O/EtOH oant 100% EtOH (gradiënt (gradiënt), 155–200 min: 100% EtOH) mei in streamsnelheid fan 1,5 ml/min, coumamonamide (1, 36,0 mg) waard isolearre as in wyt amorf poeier.
Kumamotoamide(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz, 1H), 6.05 (t, J = 3.8 Hz, 1H).), 4.08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ berekkene wearde: 141.0659, mjitten wearde: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
Columbia-siedden (Col-0) waarden krigen fan it Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC) mei tastimming foar ûndersyksgebrûk. Col-0-siedden waarden fermannichfâldige en ûnderhâlden ûnder ús laboratoariumomstannichheden en brûkt as wylde Arabidopsis-planten. Arabidopsis-siedden waarden oerflaksterilisearre en kultivearre yn healsterkte Murashige en Skoog-medium mei 2% sukrose (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05% (w/v) 2-(4-morfolino)etaansulfonzuur (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical).) en 1,5% agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, by 23 °C en konstant ljocht. Sidden fan 'e phs1-1-mutant waarden levere troch T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology).
Sied fan stam SR-1 waarden levere troch T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology) en brûkt as wylde tabaksplanten. Tabakssied waarden oan it oerflak sterilisearre en trije nachten yn steryl wetter wekke om kimen te befoarderjen, doe pleatst yn in healsterkte oplossing mei 2% sukrose, 0,05% (w/v) MES, en 0,8% gellangom (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige. en Skoog medium) mei pH 5,7 en ynkubearre by 23 °C ûnder konstant ljocht.
Stam Tak-1 waard levere troch T. Kohchi (Universiteit fan Kyoto) en waard brûkt as de standert eksperimintele ienheid foar de levermosstúdzje. Gemma waard krigen fan sterilisearre kultivearre planten en doe útplaat op Gamborg B5 medium (Fujifilm Wako Pure Chemical) mei 1% sukrose en 0,3% gellangom en ynkubearre by 23 °C ûnder kontinu ljocht.
Tabaks BY-2-sellen (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) waarden levere troch S. Hasezawa (Universiteit fan Tokio). BY-2-sellen waarden 95-fâld ferdund yn modifisearre Linsmeier en Skoog-medium en wykliks oanfolle mei 2,4-dichlorofenoxyazijnzuur 32. De selsuspensje waard mingd op in rotearjende shaker by 130 rpm by 27 °C yn it tsjuster. Waskje sellen mei 10 kear it folume fan fars medium en resuspendearje yn itselde medium. BY-2 transgene sellinen dy't stabyl de mikrotubulusmarker TagRFP-TUA6 of de aktinefilamentmarker GFP-ABD2 ekspressearje ûnder de blomkoalmozaïekfirus 35S-promotor waarden generearre lykas beskreaun 33,34,35. Dizze sellinen kinne ûnderhâlden en syngronisearre wurde mei prosedueres dy't fergelykber binne mei dy brûkt foar de orizjinele BY-2-selline.
HeLa-sellen waarden kultivearre yn Dulbecco's modifisearre Eagle's medium (DMEM) (Life Technologies) oanfolle mei 10% fetaal bovine serum, 1.2 U/ml penisilline, en 1.2 μg/ml streptomycine yn in 37°C ynkubator mei 5% CO2.
Alle eksperiminten beskreaun yn dit manuskript waarden útfierd yn oerienstimming mei Japanske biosafety-regeljouwing en rjochtlinen.
Ferbiningen waarden oplost yn dimethylsulfokside (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) as stockoplossingen en ferdund yn MS-medium foar Arabidopsis en tabak- of Gamborg B5-medium foar levermos. Foar de woartelgroei-ynhibysje-assay waarden mear as 10 siedden per plaat siedde op agarmedium mei de oanjûne ferbiningen of DMSO. De siedden waarden 7 dagen yn in groeikeamer ynkubearre. De siedlingen waarden fotografearre en de lingte fan 'e woartels waard metten. Foar de Arabidopsis-kiemingsassay waarden 48 siedden per plaat siedde op agarmedium mei 200 μM ferbining of DMSO. Arabidopsis-sieden waarden groeid yn in groeikeamer en it oantal ûntkiemde siedlingen waard 7 dagen nei ûntkieming (dag) teld. Foar de tabakkiemingsassay waarden 24 siedden per plaat siedde op agarmedium mei 200 μM KAND of DMSO. Tabakssieden waarden groeid yn in groeikeamer en it oantal ûntkiemde siedlingen waard nei 14 dagen teld. Foar de groeiremmingstest fan levermos waarden 9 embryo's fan elke plaat útplaat op agarmedium mei de oanjûne konsintraasjes fan KAND of DMSO en 14 dagen yn in groeikeamer ynkubearre.
Brûk siedlings dy't kleurd binne mei 5 mg/ml propidiumjodide (PI) om de organisaasje fan it woartelmeristeem te visualisearjen. PI-sinjalen waarden waarnommen troch fluoreszinsjemikroskopie mei in TCS SPE konfokale laserscanningmikroskoop (Leica Microsystems).
Histochemyske kleuring fan woartels mei β-glukuronidase (GUS) waard útfierd neffens it protokol beskreaun troch Malami en Benfey36. Siedlings waarden oernachtich fêstmakke yn 90% aceton, kleurd mei 0,5 mg/ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-glukuronzuur yn GUS-buffer foar 1 oere en pleatst yn in hydratisearre chloraldehyde-oplossing (8 g chloralhydraat, 2 ml wetter en 1 ml glycerol) en waarnommen troch differinsjele ynterferinsjekontrastmikroskopie mei in Axio Imager M1-mikroskoop (Carl Zeiss).
Woartelhoeken waarden metten op 7 dagen âlde siedlingen dy't groeid wiene op fertikaal pleatste platen. Mjit de hoeke fan 'e woartel út 'e rjochting fan 'e swiertekrêftfektor lykas beskreaun yn stap 6.
De opset fan kortikale mikrotubuli waard waarnommen lykas beskreaun, mei lytse oanpassingen oan it protokol 37. Anti-β-tubuline-antistof (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) en Alexa Fluor 488-konjugearre anti-mûs IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) waarden brûkt as primêre en sekundêre antistoffen by ferdunningen fan 1:1000 en 1:100, respektivelik. Fluoreszinsjeôfbyldings waarden krigen mei in TCS SPE konfokale laserscanningmikroskoop (Leica Microsystems). Ferwerve Z-stack-ôfbyldings en meitsje projeksjes mei maksimale yntensiteit neffens de ynstruksjes fan 'e fabrikant.
HeLa-selproliferaasjeassay waard útfierd mei Cell Counting Kit 8 (Dojindo) neffens de ynstruksjes fan 'e fabrikant.
De groei fan E. coli DH5α waard analysearre troch it mjitten fan seltichtens yn kultuer mei in spektrofotometer by 600 nm (OD600).
Cytoskeletale organisaasje yn transgene BY-2-sellen waard waarnommen mei in fluoreszinsjemikroskoop foarsjoen fan in CSU-X1 konfokale scanapparaat (Yokogawa) en in sCMOS-kamera (Zyla, Andor Technology). Cytoskeletale tichtens waard beoardiele troch ôfbyldingsanalyse, dy't it persintaazje cytoskeletale piksels ûnder cytoplasmatyske piksels yn konfokale ôfbyldings kwantifisearre mei ImageJ-software lykas beskreaun38,39.
Om seldea yn BY-2-sellen te detektearjen, waard in aliquot fan 'e selsuspensje 10 minuten by keamertemperatuer ynkubearre mei 0,05% Evans-blau. Selektive Evans-blauwe kleuring fan deade sellen hinget ôf fan 'e ekstrudering fan 'e kleurstof út libbensfetbere sellen troch it yntakte plasmamembraan40. Kleurde sellen waarden waarnommen mei in helderfjildmikroskoop (BX53, Olympus).
HeLa-sellen waarden groeid yn DMEM oanfolle mei 10% FBS yn in befochtige ynkubator by 37 °C en 5% CO2. Sellen waarden behannele mei 100 μM KAND 11, kumamonaminezuur 6, kumamonamide 1, 100 ng/ml colcemid (Gibco), of 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) foar 6 oeren by 37 °C. Sellen waarden 10 minuten fiksearre mei MetOH en doe 5 minuten mei asetaat by keamertemperatuer. Fêste sellen waarden ynkubearre mei β-tubuline primêr antistof (1D4A4, Proteintech: 66240-1) ferdund yn 0,5% BSA/PBS foar 2 oeren, 3 kear wosken mei TBST, en doe ynkubearre mei Alexa Fluor geite-antistof. 488 1 oere. – Mûs IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) en 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) ferdund yn 0.5% BSA/PBS. Nei it trije kear waskjen mei TBST waarden kleurde sellen waarnommen op in Nikon Eclipse Ti-E omkearde mikroskoop. Ofbyldings waarden makke mei in ôfkuolle Hamamatsu ORCA-R2 CCD-kamera mei help fan MetaMorph-software (Molecular Devices).
Pleatsingstiid: 17 juny 2024