Tankewol foar it besykjen fan Nature.com.De ferzje fan 'e browser dy't jo brûke hat beheinde CSS-stipe.Foar bêste resultaten riede wy oan dat jo in nijere ferzje fan jo blêder brûke (of kompatibiliteitsmodus útskeakelje yn Internet Explorer).Yn 'e tuskentiid, om trochgeande stipe te garandearjen, litte wy de side sjen sûnder styling of JavaScript.
De ûntdekking en foardielich gebrûk fan natuerlike produkten kinne helpe om it minsklik libben te ferbetterjen.Gemikaliën dy't plantengroei remmen wurde in protte brûkt as herbiziden om ûnkrûd te kontrolearjen.Fanwegen de needsaak om ferskate soarten herbiziden te brûken, is d'r needsaak om ferbiningen te identifisearjen mei nije aksjemeganismen.Yn dizze stúdzje ûntdutsen wy in nije N-alkoxypyrrol-ferbining, coumamonamide, fan Streptomyces werraensis MK493-CF1 en fêstige it folsleine syntezeproses.Troch biologyske aktiviteitsassays ûntdutsen wy dat urs-monoamyske sûr in syntetyske intermediate is fan urs-monoamide en in potinsjeelplant groei inhibitor.Dêrneist hawwe wy ferskate urbenonic acid derivaten ûntwikkele, ynklusyf de urbenyloxy derivative (UDA), dat hat hege herbicide aktiviteit sûnder negatyf beynfloedzje de groei fan HeLa sellen.Wy hawwe ek fûn dat urmotonyske soerderivaten fersteure plantmikrotubules;boppedat, KAND beynfloedet actin filaments en induces sel dea;Dizze mearsidige effekten ferskille fan dy fan bekende mikrotubule-ynhibitoren en suggerearje in nij meganisme fan aksje foar ursonic acid, dy't in wichtich foardiel fertsjintwurdiget yn 'e ûntwikkeling fan nije herbiziden.
De ûntdekking en praktyske tapassing fan foardielige natuerlike produkten en har derivaten is in middel om de kwaliteit fan it minsklik libben te ferbetterjen.Sekundêre metaboliten produsearre troch mikro-organismen, planten en ynsekten hawwe laat ta grutte foarútgong yn medisinen en lânbou.In protte antibiotika en anty-leukemia medisinen binne ûntwikkele út natuerlike produkten.Dêrneist ferskate soarten fanbestridingsmiddels, fungiciden en herbiziden wurde wûn út dizze natuerlike produkten foar gebrûk yn 'e lânbou.Benammen herbiziden foar ûnkrûdbestriding binne wichtige ark foar it ferheegjen fan gewaaksopbringsten yn moderne lânbou, en ferskate soarten ferbiningen wurde al kommersjeel brûkt.Ferskate sellulêre prosessen yn planten, lykas fotosynteze, aminosoerenmetabolisme, selmuorsynteze, regeling fan mitose, phytohormone-sinjalearring, of proteïnsynteze, wurde beskôge as typyske doelen fan herbiziden.Ferbinings dy't mikrotubulefunksje ynhibearje binne in mienskiplike klasse fan herbiziden dy't plantgroei beynfloedzje troch mitotyske regeling te beynfloedzjen2.
Mikrotubules binne ûnderdielen fan it cytoskelet en wurde breed bewarre yn eukaryote sellen.De tubulin heterodimer bestiet út α-tubulin en β-tubulin foarmje lineêre mikrotubule protofilaments, mei 13 protofilaments foarmje in silindryske struktuer.Mikrotubules spylje meardere rollen yn plantsellen, ynklusyf it bepalen fan selfoarm, seldieling, en intracellular transport3,4.Plantsellen befetsje mikrotubules ûnder it interphase plasmamembraan, en dizze saneamde kortikale mikrotubules wurde tocht dat se de organisaasje fan cellulosemikrofibrillen kontrolearje troch de regeling fan cellulosesyntasekompleksen4,5.Cortical mikrotubules fan woartel epidermal sellen, oanwêzich yn 'e sône fan rappe ferlinging fan' e woartel tip, lizze lateraal, en cellulose microfibers folgje dizze mikrotubules en beheine de rjochting fan sel útwreiding, dêrmei it befoarderjen fan anisotropic sel elongation.Dêrom is mikrotubulefunksje nau besibbe oan plantmorfology.Aminosoerferfangings yn genen dy't kodearje foar tubulin feroarsaakje skew fan kortikale mikrotubule-arrays en lofts- of rjochterkant groei yn Arabidopsis 6,7.Lykas mutaasjes yn mikrotubule-assosjearre aaiwiten dy't mikrotubule-dynamyk regelje kinne ek liede ta ferfoarme woartelgroei8,9,10,11,12,13.Dêrnjonken feroarsaket behanneling mei mikrotubule-fersteurende herbiziden lykas disopyramide, ek wol pretilachlor neamd, ek linkssidige oblique woartelgroei14.Dizze gegevens jouwe oan dat krekte regeling fan mikrotubulefunksje kritysk is foar it bepalen fan 'e rjochting fan plantgroei.
Ferskate soarten mikrotubule-ynhibitoren binne ûntdutsen, en dizze medisinen hawwe in wichtige bydrage levere oan cytoskeletale ûndersyk, lykas oan lânbou en medisinen2.Benammen oryzalin, dinitroaniline ferbiningen, disopyramide, benzamide-relatearre ferbiningen, en harren analogen kinne inhibit microtubule funksje en dêrmei inhibit plant groei.Dêrom wurde se in protte brûkt as herbiziden.Om't mikrotubules lykwols in wichtige komponint binne fan plant- en diersellen, binne de measte mikrotubule-ynhibitoren cytotoxysk foar beide seltypen.Dêrom, nettsjinsteande harren erkende nut as herbiziden, in beheind oantal antimicrotubule aginten wurde brûkt foar praktyske doelen.
Streptomyces is in skaai fan 'e famylje Streptomyces, dy't aërobe, gram-positive, filamentous baktearjes omfettet en is rûnom bekend om syn fermogen om in breed oanbod fan sekundêre metaboliten te produsearjen.Dêrom wurdt it beskôge as ien fan 'e wichtichste boarnen fan nije biologysk aktive natuerlike produkten.Yn 'e hjoeddeistige stúdzje ûntdutsen wy in nije ferbining neamd coumamonamide, dy't isolearre waard fan Streptomyces werraensis MK493-CF1 en S. werraensis ISP 5486. Mei help fan spektrale analyze en folsleine spektrale analyze waard de struktuer fan coumamonamide karakterisearre en syn unike N-alkoxypyrrol skelet waard bepaald.synteze.Ursmonic acid, in syntetyske tuskenpersoan fan ursmonoamide en syn derivaten, waard fûn om de groei en kieming fan 'e populêre modelplant Arabidopsis thaliana te remmen.Yn in struktuer-aktiviteit relaasje stúdzje fûnen wy dat in ferbining mei C9 modifisearre ta ursonic acid, neamd nonyloxy derivative fan ursonic acid (KAND), signifikant fersterket it remmende effekt op groei en germinaasje.Opmerklik, de nij ûntdutsen plant groei inhibitor ek beynfloede de groei fan tabak en leverwort en wie net cytotoxik foar baktearjes of HeLa sellen.Boppedat, guon urmotonic acid derivaten induce in ferfoarme woartel fenotype, wat betsjut dat dizze derivaten direkt of yndirekt beynfloedzje mikrotubules.Yn oerienstimming mei dit idee jouwe ús beoardielingen fan mikrotubules oan dat immunohistochemysk of mei fluorescent aaiwiten markearre binne dat KAND-behanneling mikrotubules depolymerisearret.Dêrnjonken fersteurde behanneling mei kumamotonyske soerderivaten actin-mikrofilaminten.Sa hawwe wy in nije plantgroei-inhibitor ûntdutsen waans unike meganisme fan aksje omfettet ferneatiging fan it cytoskelet.
Stam MK493-CF1 waard isolearre út boaiem yn Shinagawa-ku, Tokio.Stam MK493-CF1 foarme goed fertakte stromale mycelium.De parsjele folchoarder fan it 16S ribosomale RNA-gen (1422 bp) waard bepaald.Dizze stam is tige ferlykber mei S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: typyske stam, 99,93%).Op grûn fan dit resultaat waard fêststeld dat dizze stam nau besibbe wie oan de typestam fan S. werraensis.Dêrom neamden wy dizze stam foarlopich S. werraensis MK493-CF1.S. werraensis ISP 5486T produsearret ek deselde bioaktive ferbiningen.Sûnt der wie net folle betiid ûndersyk nei it krijen fan natuerlike produkten út dit mikro-organisme, fierder gemysk ûndersyk waard útfierd.Nei it kultivearjen fan S. werraensis MK493-CF1 op gerst medium troch fêste-state fermentaasje by 30 ° C foar 14 dagen, it medium waard ekstrahearre mei 50% EtOH.60 ml monster waard droech om 59,5 mg rau ekstrakt te krijen.It rûge ekstrakt waard ûnderwurpen oan omkearde faze HPLC om N-methoxy-1H-pyrrol-2-carboxamide (1, neamd coumamonamide, 36.0 mg) te jaan.It totale bedrach fan 1 is sawat 60% fan it rûge ekstrakt.Dêrom besleaten wy de eigenskippen fan kumamotoamide 1 yn detail te bestudearjen.
Coumamonamide 1 is in wyt amorf poeder en hege resolúsje massa spektrometrie (HRESIMS) befêstiget C6H8N2O2 (Fig. 1).It C2-substituearre pyrrolfragmint fan dizze ferbining wurdt karakterisearre troch δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH yn 1H NMR-spektrum: 4.5 Hz , H-5) en δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6), en it 13C NMR-spektrum toant de oanwêzigens fan fjouwer sp2-koalstofatomen.De oanwêzigens fan in amidegroep op 'e C2-posysje waard beoardiele troch HMBC-korrelaasje fan it C-3-proton nei it amide-karbonylkoalstof by δC 161.1.Dêrnjonken jouwe 1H en 13C NMR-peaks by δH 4.10 (3H, S) en δC 68.3 de oanwêzigens fan N-methoxygroepen yn 'e molekule oan.Hoewol de krekte posysje fan 'e metoksygroep noch net fêststeld wie mei spektroskopyske analyze lykas ferbettere ferskilspektroskopy en nukleêre Overhauser-ôfkoarting (NOEDF), waard N-methoxy-1H-pyrrol-2-carboxamide de earste kandidaatferbining.
Om de krekte struktuer fan 1 te bepalen, waard in totale synteze útfierd (fig. 2a).Behanneling fan kommersjeel beskikber 2-aminopyridine 2 mei m-CPBA resultearre yn it oerienkommende N-oxide 3 yn kwantitative opbringst.Nei de 2-aminoazidaasje fan 2 waard de siklokondensaasjereaksje beskreaun troch Abramovich útfierd yn benzene by 90 ° C om de winske 1-hydroxy-1H-pyrrol-2-karbonitril 5 yn gram te krijen.Faasje 60% (twa stadia).15,16.Methylaasje en hydrolyse fan 4 joech dan 1-methoxy-1H-pyrrol-2-carboxylic acid (neamd "cumotonic acid", 6) yn goede opbringst (70%, twa stappen).Uteinlik joech amidaasje fia soere chloride tuskenmiddel 6 mei help fan wetterige ammoniak Kumamoto amide 1 yn 98% opbringst.Alle spektrale gegevens fan synthesized 1 wiene fergelykber mei isolearre 1, sadat de struktuer fan 1 waard bepaald;
Algemiene synteze en analyze fan de biologyske aktiviteit fan urbenamide en urbenic acid.(a) Totale synteze fan Kumamoto amide.(b) Sân-dagen-âlde wylde type Arabidopsis Columbia (Col) seedlings waarden groeid op Murashige en Skoog (MS) platen mei coumamonamide 6 of coumamonamide 1 by de oantsjutte konsintraasjes.Skaalbalke = 1 sm.
Earst beoardielje wy de biologyske aktiviteiten fan urbenamide en har intermediates foar har fermogen om plantgroei te moduleren.Wy tafoege ferskate konsintraasjes fan ursmonamide 1 of ursmonic acid 6 oan MS agar medium en kweekte Arabidopsis thaliana seedlings op dit medium.Dizze assays lieten sjen dat hege konsintraasjes (500 μM) fan 6 de woartelgroei ynhibeare (fig. 2b).Dêrnei genereare wy ferskate derivaten troch de N1-posysje fan 6 te ferfangen en struktuer-aktiviteit relaasjestúdzjes op har útfierd (it analoge syntezeproses wurdt beskreaun yn 'e Stypjende ynformaasje (SI)).Arabidopsis-seedlings waarden groeid op in medium dat 50 μM ursonic acid-derivaten befette, en de woartellingte waard mjitten.lykas it werjûn op 'e foto.Lykas werjûn yn figueren 3a, b, en S1, coumamo soeren hawwe ferskillende lingtes fan lineêre alkoxy keatlingen (9, 10, 11, 12, en 13) of grutte alkoxy keatlingen (15, 16, en 17) op de N1 posysje.De derivaten lieten signifikante remming fan woartelgroei sjen.Dêrnjonken fûnen wy dat tapassing fan 200 μM 10, 11, of 17 ynhibearre germinaasje (figueren 3c en S2).
Stúdzje fan 'e struktuer-aktiviteit relaasje fan Kumamoto amide en relatearre ferbiningen.(a) Struktuer en syntezeskema fan analogen.(b) Kwantifikaasje fan woartellingte fan 7-dagen-âlde seedlings groeid op MS-medium mei of sûnder 50 μM coumamonamide-derivaten.Asterisken jouwe signifikante ferskillen oan mei sham-behanneling (t-test, p< 0,05).n>18. Gegevens wurde toand as gemiddelde ± SD.nt betsjut "net hifke" om't mear as 50% fan 'e sieden net kimen.(c) Kwantifikaasje fan kiemingsnivo fan behannele sieden ynkubeare foar 7 dagen yn MS-medium mei of sûnder 200 μM coumamonamide en besibbe ferbiningen.Asterisken jouwe signifikante ferskillen mei sham behanneling (chi-kwadraat test).n=96.
Ynteressant fermindere de tafoeging fan alkyl-sideketen langer dan C9 de remmende aktiviteit, wat suggerearret dat kumamotoic acid-relatearre ferbiningen sydketens fan in bepaalde grutte fereaskje om har biologyske aktiviteit te eksposearjen.
Om't struktuer-aktiviteit relaasje analyze die bliken dat C9 waard feroare ta ursonic acid en de nonyloxy derivative fan ursonic acid (hjirnei oantsjutten as KAND 11) wie de meast effektive plant groei inhibitor, wy fierden in mear detaillearre karakterisaasje fan KAND 11. Behanneling fan Arabidopsis mei 50 μM KAND 11 hast hielendal foarkaam germination, wylst legere konsintraasjes (40, 30, 20, of 10 μM) fan KAND 11 inhibited woartel groei yn in dose-ôfhinklike wize (Fig. 4a, b).Om te testen oft KAND 11 de leefberens fan woartelmeristem beynfloedet, ûndersochten wy woartelmeristemen kleurd mei propidiumiodide (PI) en mjitten meristeemgebietgrutte.De grutte fan 'e meristem fan seedlings groeid op in medium mei 25 μM KAND-11 wie 151.1 ± 32.5 μm, wylst de grutte fan' e meristem fan seedlings groeid op in kontrôlemedium mei DMSO wie 264.7 ± 30.8 μm (fig. 4c, d) , wat oanjout dat KAND-11 sellulêre aktiviteit herstelt.fersprieding.Root meristem.Yn oerienstimming mei dizze, KAND 11 behanneling fermindere it bedrach fan sel divyzje marker CDKB2; 1p :: CDKB2; 1-GUS sinjaal yn de woartel meristem (figuer 4e) 17.Dizze resultaten jouwe oan dat KAND 11 woartelgroei ynhibeart troch selproliferaasjeaktiviteit te ferminderjen.
Analyse fan it remmende effekt fan urbenonic acid-derivaten (urbenyloxy-derivaten) op groei.(in) 7-dagen-âlde wylde type Col seedlings groeid op MS platen mei de oantsjutte konsintraasjes fan KAND 11. Skaal bar = 1 sm.(b) Kwantifikaasje fan woartel lingte.Letters jouwe wichtige ferskillen oan (Tukey HSD-test, p< 0,05).n>16. Gegevens wurde toand as gemiddelde ± SD.(c) Confocal mikroskopy fan propidium iodide-bevlekte wylde-type Col woartels groeid op MS platen mei of sûnder 25 μM KAND 11. Wite heakjes jouwe root meristem.Skaalbalke = 100 µm.(d) Kwantifikaasje fan root meristem grutte (n = 10 oan 11).Statistyske ferskillen waarden bepaald mei t-test (p< 0,05).De balken fertsjintwurdigje de gemiddelde meristemgrutte.(e) Differinsjaal ynterferinsjekontrast (DIC) mikroskopy fan in woartelmeristem mei it CDKB2-konstruksje;1pro: CDKB2;1-GUS kleurde en kleurde op 5-dagen-âlde seedlings groeid op MS-platen mei of sûnder 25 µM KAND-assay.
De fytotoxiciteit fan KAND 11 waard fierder hifke mei in oare dicotyledone plant, tabak (Nicotiana tabacum), en in wichtich lânplantmodelorganisme, leverwort (Marchantia polymorpha).Lykas yn it gefal fan Arabidopsis, tabak SR-1 seedlings groeid op medium mei 25 μM KAND 11 produsearre koartere woartels (Fig. 5a).Derneist kiemden 40 fan 48 sieden op platen mei 200 μM KAND 11, wylst alle 48 sieden op mock-behannele media kimen, wat oanjout dat hegere konsintraasjes fan KAND signifikant wiene (p< 0.05;chi test -square) remme de kieming fan tabak.(ôfb. 5b).Dêrnjonken wie de konsintraasje fan KAND 11 dy't baktearjele groei yn leverwort ynhibearre wie fergelykber mei de effektive konsintraasje yn Arabidopsis (fig. 5c).Dizze resultaten jouwe oan dat KAND 11 de groei fan in ferskaat oan planten kin remme.Wy ûndersochten doe de mooglike cytotoxisiteit fan bear monoamide-relatearre ferbiningen yn oare organismen, nammentlik minsklike HeLa-sellen en Escherichia coli-stam DH5α, as fertsjintwurdigers fan respektivelik hegere dier- en baktearjesellen.Yn in searje fan selproliferaasje-assays hawwe wy observearre dat coumamonamide 1, coumamonamidic acid 6, en KAND 11 gjin ynfloed op it groei fan HeLa of E. coli-sellen by konsintraasjes fan 100 μM (Fig. 5d, e).
Groei-ynhibysje fan KAND 11 yn net-Arabidopsis-organismen.(a) Twa wike âlde wylde type SR-1 tabak seedlings waarden groeid op fertikaal pleatste MS platen mei 25 μM KAND 11. (b) Twa wiken âlde wylde type SR-1 tabak seedlings waarden groeid op horizontaal pleatst MS platen befetsjende 200 μM KAND 11. (c) Twa wiken âlde wylde type Tak-1 leverwort knoppen groeid op Gamborg B5 platen mei de oantsjutte konsintraasjes fan KAND 11. Reade pylken jouwe spoaren dy't stoppe groeie binnen de twa wiken incubation perioade.(d) Selsproliferaasje-assay fan HeLa-sellen.It oantal libbensfetbere sellen waard mjitten op fêste tiid yntervallen mei help fan in sel tellen kit 8 (Dojindo).As kontrôle waarden HeLa-sellen behannele mei 5 μg / ml actinomycin D (Act D), dy't RNA-polymerase-transkripsje ynhibeart en sels dea feroarsaket.Analysen waarden útfierd yn triplicate.(e) E. coli sel proliferaasje assay.E. coli groei waard analysearre troch mjitten OD600.As kontrôle waarden sellen behannele mei 50 μg / ml ampicilline (Amp), dy't de synteze fan baktearjele muorre ynhibeart.Analysen waarden útfierd yn triplicate.
Om it meganisme fan aksje fan cytotoxiciteit te ûntsiferjen feroarsake troch uramide-relatearre ferbiningen, analysearren wy urbenic acid-derivaten mei matige remmende effekten.lykas it werjûn op 'e foto.Lykas werjûn yn figueren 2b, 6a, produsearren seedlings groeid op agarplaten dy't hege konsintraasjes (200 μM) fan urmotonic acid 6 befette, koartere en lofts bûgde woartels (θ = - 23.7 ± 6.1), wylst seedlings groeid op it kontrôlemedium, de seedlings produsearre hast rjochte woartels (θ = – 3,8 ± 7,1).Dizze karakteristike skuorre groei is bekend as gefolch fan dysfunksje fan kortikale mikrotubules14,18.Yn oerienstimming mei dizze fynst feroarsake de mikrotubule-destabilisearjende medisinen disopyramide en oryzalin ferlykbere woartel tilting ûnder ús groeibetingsten (Fig. 2b, 6a).Tagelyk testen wy urmotonyske soerderivaten en selekteare ferskate dêrfan dy't, by bepaalde konsintraasjes, skuorre woartelgroei feroarsake.Ferbinings 8, 9 en 15 feroare de rjochting fan woartelgroei op respektivelik 75 μM, 50 μM en 40 μM, wat oanjout dat dizze ferbiningen mikrotubules effektyf destabilisearje kinne (Fig. 2b, 6a).Wy testten ek de machtichste ursolic acid derivative, KAND 11, by in legere konsintraasje (15 µM) en fûnen dat tapassing fan KAND 11 de woartelgroei ynhibearde en dat de rjochting fan woartelgroei unjildich wie, hoewol se neigeande nei lofts hellen ( figuer C3)..Om't hegere konsintraasjes fan mikrotubule-destabilisearjende medisinen soms plantgroei ynhibearje ynstee fan woarteltilting, beoardielje wy dêrnei de mooglikheid dat KAND 11 mikrotubules beynfloedet troch te observearjen fan kortikale mikrotubules yn root-epidermale sellen.Immunohistochemistry mei help fan anty-β-tubulin antykladen yn epidermale sellen fan seedlingswurzels behannele mei 25 μM KAND 11 toande it ferdwinen fan hast alle kortikale mikrotubules yn epidermale sellen yn 'e ferlingingssône (Fig. 6b).Dizze resultaten jouwe oan dat kumamotonsoer en syn derivaten direkt of yndirekt op mikrotubules wurkje om se te fersteuren en dat dizze ferbiningen nije mikrotubule-ynhibitoren binne.
Ursonic acid en syn derivaten feroarje kortikale mikrotubules yn Arabidopsis thaliana.(a) Root oanstriidhoeke mjitten yn 'e oanwêzigens fan ferskate urmotonyske soerderivaten by de oantsjutte konsintraasjes.De effekten fan twa ferbiningen dy't bekend binne om mikrotubules te ynhibearjen: disopyramide en oryzalin waarden ek analysearre.De ynset toant de standert brûkt om de hoeke fan woartelgroei te mjitten.Asterisken jouwe signifikante ferskillen oan mei sham-behanneling (t-test, p< 0,05).n>19. Skaalbalke = 1 sm.(b) Kortikale mikrotubules yn epidermale sellen yn 'e ferlingingssône.Mikrotubules yn wylde-type Arabidopsis Col-wurzels groeid op MS-platen mei of sûnder 25 μM KAND 11 waarden visualisearre troch immunhistochemyske kleuring mei β-tubulin primêre antylders en Alexa Fluor-konjugearre sekundêre antylders.Skaalbalke = 10 µm.(c) Mitotyske struktuer fan mikrotubules yn 'e woartelmeristem.Mikrotubules waarden visualisearre mei immunohistochemyske kleuring.Mitotyske struktueren, ynklusyf profase-sônes, spindels en phragmoplasten, waarden teld út konfokale bylden.Pylken jouwe mitotyske mikrotubulestruktueren oan.Asterisken jouwe signifikante ferskillen oan mei sham-behanneling (t-test, p< 0,05).n>9. Skaalbalke = 50 µm.
Hoewol Ursa hat de mooglikheid om mikrotubulefunksje te fersteuren, wurdt ferwachte dat har meganisme fan aksje oars is fan typyske mikrotubule-depolymerisearjende aginten.Bygelyks, hegere konsintraasjes fan mikrotubule-depolymerisearjende aginten lykas disopyramide en oryzalin inducearje anisotropyske útwreiding fan epidermale sellen, wylst KAND 11 dat net docht.Dêrnjonken resultearre co-applikaasje fan KAND 11 en disopyramide yn in kombinearre disopyramide-induzearre root-groei-antwurd en KAND 11-induzearre groei-ynhibysje waard waarnommen (Fig. S4).Wy analysearren ek de reaksje fan 'e hypersensitive disopyramide 1-1 (phs1-1) mutant nei KAND 11. phs1-1 hat in net-kanonike tubulin kinase punt mutaasje en produsearret koartere woartels as behannele mei disopyramide9,20.phs1-1 mutant seedlings groeid op agar medium containing KAND 11 hie koartere woartels fergelykber mei dy groeid op disopyramid (fig. S5).
Dêrnjonken observearren wy mitotyske mikrotubule-struktueren, lykas profase-sônes, spindels en phragmoplasts, yn 'e woartelmeristem fan seedlings behannele mei KAND 11. Yn oerienstimming mei de beoardielingen foar CDKB2;1p :: CDKB2;1-GUS, in signifikante fermindering yn it oantal mitotic microtubules waard waarnommen (Fig. .6c).
Om de cytotoxisiteit fan KAND 11 by subsellulêre resolúsje te karakterisearjen, behannelen wy tabak BY-2-suspensjonele sellen mei KAND 11 en observearre har reaksje.Wy hawwe earst KAND 11 tafoege oan BY-2-sellen dy't TagRFP-TUA6 útdrukke, dy't mikrotubules fluorescent markearje, om it effekt fan KAND 11 op kortikale mikrotubules te beoardieljen.Kortikale mikrotubule-tichtens waard beoardiele mei ôfbyldingsanalyse, dy't it persintaazje cytoskeletale piksels kwantifisearre ûnder cytoplasmyske piksels.De resultaten fan 'e assay lieten sjen dat nei behanneling mei 50 μM of 100 μM KAND 11 foar 1 oere, de tichtheid signifikant fermindere nei respektivelik 0.94 ± 0.74% of 0.23 ± 0.28%, wylst de tichtens fan sellen behannele mei DMSO 61 ± 0 . % (Fig. 7a).Dizze resultaten binne yn oerienstimming mei de beoardieling yn Arabidopsis dat KAND 11-behanneling depolymerisaasje fan kortikale mikrotubules feroarsaket (Fig. 6b).Wy ûndersochten ek de BY-2 line mei GFP-ABD-labele actin filaments nei behanneling mei deselde konsintraasje fan KAND 11 en observearre dat KAND 11 behanneling fersteurd de actin filaments.Behanneling mei 50 μM of 100 μM KAND 11 foar 1 h signifikant fermindere actin filament tichtens oan 1.20 ± 0.62% of 0.61 ± 0.26%, respektivelik, wylst de tichtens yn DMSO-behannele sellen wie 1.69 ± .F ± .F).7b).Dizze resultaten kontrastearje mei de effekten fan propyzamide, dy't gjin actin-filaminten beynfloedzje, en latrunculin B, in actin-depolymerisator dy't gjin mikrotubules beynfloedet (SI Figure S6).Dêrnjonken hat behanneling mei coumamonamide 1, coumamonamide acid 6, of KAND 11 gjin ynfloed op mikrotubules yn HeLa-sellen (SI Figure S7).Sa wurdt leaud dat it meganisme fan aksje fan KAND 11 oars is as dat fan bekende cytoskelet-fersteurers.Dêrnjonken iepenbiere ús mikroskopyske observaasje fan BY-2-sellen behannele mei KAND 11 it begjin fan seldea yn 'e KAND 11-behanneling en liet sjen dat it oanpart fan Evans blau-bevlekte deade sellen net signifikant tanommen nei 30 min fan KAND 11-behanneling, wylst nei 90 minuten fan behanneling mei 50 μM of 100 μM KAND, ferhege it oantal deade sellen nei respektivelik 43,7% of 80,1% (fig. 7c).Mei-elkoar jouwe dizze gegevens oan dat it nije ursolic acid derivative KAND 11 in plantspesifike cytoskeletale ynhibitor is mei in earder ûnbekend meganisme fan aksje.
KAND beynfloedet kortikale mikrotubules, actin filaments, en leefberens fan tabak BY-2 sellen.(a) Fisualisaasje fan kortikale mikrotubules yn BY-2-sellen yn 'e oanwêzigens fan TagRFP-TUA6.BY-2-sellen behannele mei KAND 11 (50 μM of 100 μM) of DMSO waarden ûndersocht troch konfokale mikroskopy.Cortical microtubule tichtens waard berekkene út micrographs fan 25 ûnôfhinklike sellen.Letters jouwe wichtige ferskillen oan (Tukey HSD-test, p< 0,05).Skaalbalke = 10 µm.(b) Cortical actin filaments yn BY-2 sellen fisualisearre yn 'e oanwêzigens fan GFP-ABD2.BY-2-sellen behannele mei KAND 11 (50 μM of 100 μM) of DMSO waarden ûndersocht troch konfokale mikroskopy.De tichtens fan kortikale actin filaments waard berekkene út mikrografen fan 25 ûnôfhinklike sellen.Letters jouwe wichtige ferskillen oan (Tukey HSD-test, p< 0,05).Skaalbalke = 10 µm.(c) Observaasje fan deade BY-2 sellen troch Evans blauwe kleuring.BY-2-sellen behannele mei KAND 11 (50 μM of 100 μM) of DMSO waarden ûndersocht troch ljochtfjildmikroskopie.n=3.Skaalbalke = 100 µm.
De ûntdekking en tapassing fan nije natuerlike produkten hat laat ta wichtige foarútgong yn ferskate aspekten fan it minsklik libben, ynklusyf medisinen en lânbou.Histoarysk ûndersyk is útfierd om nuttige ferbiningen te krijen út natuerlike boarnen.Benammen actinomycetes binne bekend om nuttich te wêzen as antiparasitêre antibiotika foar nematoden fanwegen har fermogen om ferskate sekundêre metaboliten te produsearjen lykas avermectin, de liedende ferbining fan ivermectin en bleomycin en har derivaten, medysk brûkt as antykankermiddel21,22.Likegoed binne in ferskaat oan herbizide ferbiningen ûntdutsen út actinomycetes, wêrfan guon al kommersjeel brûkt wurde1,23.Dêrom wurdt de analyze fan actinomycete-metaboliten om natuerlike produkten te isolearjen mei winske biologyske aktiviteiten as in effektive strategy beskôge.Yn dizze stúdzje ûntdutsen wy in nije ferbining, coumamonamide, fan S. werraensis en synthesisearre it mei súkses.Ursonic acid is in syntetyske intermediate fan urbenamide en syn derivaten.It kin karakteristike woartelkrullen feroarsaakje, matige oant sterke herbizide aktiviteit eksposearje, en direkt of yndirekt skea oan plantmikrotubules.It meganisme fan aksje fan urmotonyske sûr kin lykwols ferskille fan dat fan besteande mikrotubule-ynhibitoren, om't KAND 11 ek actin-filaminten fersteurt en selde dea feroarsaket, wat suggerearret in regeljouwingmeganisme wêrby't urmotonyske sûr en har derivaten in breed oanbod fan cytoskeletale struktueren beynfloedzje..
Fierdere detaillearre karakterisearring fan urbenonic acid sil helpe om better begripe it meganisme fan aksje fan urbenonic acid.Benammen it folgjende doel is om it fermogen fan ursonic acid te evaluearjen om te binen oan fermindere mikrotubules om te bepalen oft ursonic acid en har derivaten direkt op mikrotubules hannelje en har depolymerisearje, of oft har aksje resultaat yn mikrotubule-destabilisaasje.Derneist, yn it gefal wêr't mikrotubules gjin direkte doel binne, sil it identifisearjen fan 'e side fan aksje en molekulêre doelen fan ursonic acid op plantzellen helpe om de eigenskippen fan relatearre ferbiningen en mooglike manieren te ferbetterjen om herbizide aktiviteit te ferbetterjen.Us bioaktiviteit-assay iepenbiere it unike cytotoxyske fermogen fan ursonic acid op 'e groei fan planten lykas Arabidopsis thaliana, tabak en leverwort, wylst noch E. coli noch HeLa-sellen waarden beynfloede.Lytse as gjin toxicity foar bisten sellen is in foardiel fan ursonic acid derivaten as se wurde ûntwikkele as herbiziden foar gebrûk yn iepen agraryske fjilden.Om't mikrotubules gewoane struktueren binne yn eukaryoten, is har selektive remming yn planten in wichtige eask foar herbiziden.Bygelyks, propyzamide, in mikrotubule-depolymerisearjende agint dy't direkt bynt oan tubulin en polymerisaasje ynhibeart, wurdt brûkt as herbizid fanwegen syn lege toxiciteit foar bistesellen24.Yn tsjinstelling ta disopyramide hawwe relatearre benzamiden ferskillende doelspesifisiteiten.Neist plant mikrotubules, RH-4032 of benzoxamide ek inhibits microtubules fan bist sellen of oomycetes, respektivelik, en zalilamide wurdt brûkt as fungicide fanwege syn lege phytotoxicity25,26,27.De nij ûntdutsen bear en syn derivaten fertoane selektive cytotoxiciteit tsjin planten, mar it is de muoite wurdich op te merken dat fierdere oanpassingen har doelspesifisiteit kinne feroarje, mooglik ekstra derivaten leverje foar de kontrôle fan pathogene fungi of oomycetes.
De unike eigenskippen fan urbenonic acid en syn derivaten binne nuttich foar harren ûntwikkeling as herbiziden en gebrûk as ûndersyk ark.It belang fan it cytoskelet by it kontrolearjen fan plantselfoarm wurdt breed erkend.Eardere ûndersiken hawwe oantoand dat planten komplekse meganismen fan kortikale mikrotubule-organisaasje hawwe ûntwikkele troch mikrotubule-dynamyk te kontrolearjen om morfogenese goed te kontrolearjen.In grut oantal molekulen ferantwurdlik foar de regeling fan mikrotubule aktiviteit binne identifisearre, en relatearre ûndersyk is noch oanhâldend3,4,28.Us hjoeddeistige begryp fan mikrotubule-dynamyk yn plantsellen ferklearret de meganismen fan kortikale mikrotubule-organisaasje net folslein.Bygelyks, hoewol sawol disopyramide as oryzalin mikrotubules depolymerisearje kinne, feroarsaket disopyramide slimme root-ferfoarming, wylst oryzalin in relatyf myld effekt hat.Boppedat feroarsaakje mutaasjes yn tubulin, dy't mikrotubules stabilisearret, ek dextrorotaasje yn 'e woartels, wylst paclitaxel, dy't ek mikrotubule-dynamyk stabilisearret, net docht.Dêrom moat it studearjen en identifisearjen fan 'e molekulêre doelen fan ursolic acid nije ynsjoch leverje yn' e regeling fan plant cortical microtubules.Likemin sille takomstige fergelikingen fan gemikaliën dy't effektyf binne yn it befoarderjen fan ferfoarme groei, lykas disopyramide, en minder effektive gemikaliën, lykas oryzalin of kumamotoric acid, oanwizings leverje oer hoe't ferfoarme groei bart.
Oan 'e oare kant binne definsje-relatearre cytoskeletale weryndielingen in oare mooglikheid om de cytotoxisiteit fan ursonic acid te ferklearjen.Ynfeksje fan in sykteferwekker of yntroduksje fan in elicitor yn plantsellen feroarsaket soms ferneatiging fan it cytoskelet en dêropfolgjende seldea29.Bygelyks, oomycete-ôflaat cryptoxanthin is rapportearre om mikrotubules en actin-filaminten te fersteuren foarôfgeand oan tabakseldea, fergelykber mei wat bart mei KAND-behanneling30,31.De oerienkomsten tusken definsje-antwurden en sellulêre antwurden dy't troch ursonic acid feroarsake binne liede ús om te hypoteze dat se gewoane sellulêre prosessen útlizze, hoewol in flugger en sterker effekt fan ursonic acid dan cryptoxanthin is evident.Stúdzjes hawwe lykwols oantoand dat fersteuring fan actin-filaminten de spontane seldea befoarderet, dy't net altyd begelaat wurdt troch mikrotubule-fersteuring29.Dêrnjonken bliuwt it te sjen oft de pathogen of elicitor ferfoarme woartelgroei feroarsaket, lykas ursonyske soerderivaten dogge.Sa is molekulêre kennis dy't ferdigeningsantwurden keppele en it cytoskelet in oantreklik probleem om oan te pakken.Troch it brûken fan de oanwêzigens fan ferbiningen mei leech molekulêre gewicht relatearre oan ursonic acid, lykas ek in ferskaat oan derivaten mei wikseljende krêften, kinne se kânsen leverje om ûnbekende sellulêre meganismen te rjochtsjen.
Mei-inoar sille de ûntdekking en tapassing fan nije ferbiningen dy't mikrotubule-dynamyk moduleare, krêftige metoaden leverje om de komplekse molekulêre meganismen oan te pakken dy't ûnderlizzende plantselfoarmfoarming oanpakke.Yn dit ferbân kin de koartlyn ûntwikkele gearstalde urmotonyske sûr, dy't mikrotubules en actin-filaminten beynfloedet en sels dea feroarsaket, in kâns jaan om de ferbining tusken mikrotubulekontrôle en dizze oare meganismen te ûntsiferjen.Sa sil gemyske en biologyske analyze mei urbenonic acid ús helpe om de molekulêre regelmeganismen te begripen dy't it cytoskelet fan planten kontrolearje.
Ynokulearje S. werraensis MK493-CF1 yn in 500 mL ferbjustere Erlenmeyer-kolf mei 110 mL siedmedium besteande út 2% (w/v) galactose, 2% (w/v) Essence-pasta, 1% (w/v) Bacto-komposysje .-soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5% (w/v) maisekstrakt (KOGOSTCH Co., Ltd., Japan), 0,2% (w/v) (NH4) 2SO4 en 0,2% CaCO3 yn deionisearre wetter.(pH 7.4 foar sterilisaasje).De siedkultueren waarden ynkubeare op in rotary shaker (180 rpm) by 27 ° C foar 2 dagen.Produksje teelt fia fermentaasje yn fêste steat.De siedkultuer (7 ml) waard oerbrocht yn in 500 ml K-1 kolf mei 40 g produksjemedium besteande út 15 g yndrukte gerst (MUSO Co., Ltd., Japan) en 25 g deionisearre wetter (pH net oanpast foar sterilisaasje).).Fermentaasje waard útfierd by 30 ° C yn it tsjuster foar 14 dagen.It fermentaasjemateriaal waard ekstrahearre mei 40 ml / flesse EtOH en sintrifuge (1500 g, 4 ° C, 10 min).De kultuersupernatant (60 ml) waard ekstrahearre mei in mingsel fan 10% MeOH/EtOAc.De organyske laach waard ûnder fermindere druk ferdampt om in residu te krijen (59.5 mg), dat waard ûnderwurpen oan HPLC mei gradienteluaasje (0-10 minuten: 90%) op in omkearde fazekolom (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × lingte 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 minuten: 90% H2O/CH3CN oant 70% H2O/CH3CN (gradient), 35–45 minuten: 90% H2O/EtOH, 45–155 minuten: 90% H2O / EtOH nei 100% EtOH (gradient (gradient), 155-200 min: 100% EtOH) by in trochstreaming fan 1.5 ml / min, coumamonamide (1, 36.0 mg) waard isolearre as in wyt amorf poeder.
Kumamotoamide(1);1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05 (t, J = 3.8 Hz, 1H).), 4,08 (s, 3H);13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3;ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ berekkene wearde: 141.0659, mjitten wearde: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, – 15.
Columbia-sieden (Col-0) waarden krigen fan it Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC) mei tastimming foar ûndersyksgebrûk.Col-0-sieden waarden propagearre en ûnderhâlden ûnder ús laboratoariumbetingsten en brûkt as wyldtype Arabidopsis-planten.Arabidopsis-sieden waarden oerflaksterilisearre en yn kultuer brocht yn heal-sterkte Murashige en Skoog-medium mei 2% sukrose (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05% (w/v) 2-(4-morfolino) ethanesulfonic acid (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical) ).) en 1,5% agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, by 23 °C en konstant ljocht.Siedingen fan 'e phs1-1 mutant waarden levere troch T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology).
Sieden fan stam SR-1 waarden fersoarge troch T. Hashimoto (Nara Ynstitút foar Wittenskip en Technology) en brûkt as wyld-type tabak planten.Tabak sieden waarden oerflaksterilisearre en trije nachten yn sterile wetter weagje om kimen te befoarderjen, dan pleatst yn in healsterkte oplossing mei 2% sukrose, 0,05% (w / v) MES, en 0,8% gellan gum (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige.en Skoog medium) mei pH 5.7 en ynkubearre by 23 ° C ûnder konstant ljocht.
Strain Tak-1 waard levere troch T. Kohchi (Kyoto University) en waard brûkt as de standert eksperimintele ienheid foar de leverwort stúdzje.Gemma waard krigen fan sterilisearre kultuerplanten en dan plated op Gamborg B5 medium (Fujifilm Wako Pure Chemical) mei 1% sukrose en 0,3% gellangom en ynkubeare by 23 ° C ûnder kontinu ljocht.
Tabak BY-2 sellen (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) waard fersoarge troch S. Hasezawa (Universiteit fan Tokio).BY-2 sellen waarden verdund 95-fold yn modifisearre Linsmeier en Skoog medium en oanfolle wykliks mei 2,4-dichlorophenoxyacetic acid 32.De selsuspensje waard mingd op in rotearjende shaker by 130 rpm by 27 ° C yn it tsjuster.Sellen waskje mei 10 kear it folume fan farsk medium en resuspendearje yn itselde medium.BY-2 transgene sellenlinen dy't de mikrotubule-marker TagRFP-TUA6 of de actin-filamentmarker GFP-ABD2 stabyl ekspresje ûnder de blomkoalmozaïekfirus 35S-promotor waarden generearre lykas beskreaun33,34,35.Dizze sellenlinen kinne wurde ûnderhâlden en syngronisearre mei prosedueres fergelykber mei dy brûkt foar de orizjinele BY-2-selline.
HeLa-sellen waarden kultivearre yn Dulbecco's modifisearre Eagle's medium (DMEM) (Life Technologies) oanfolle mei 10% fetale bovine serum, 1.2 U / ml penicilline, en 1.2 μg / ml streptomycin yn in 37 ° C incubator mei 5% CO2.
Alle eksperiminten beskreaun yn dit manuskript waarden útfierd yn oerienstimming mei Japanske regeljouwing en rjochtlinen foar biofeiligens.
Ferbinings waarden oplost yn dimethyl sulfoxide (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) as stock oplossings en verdund yn MS medium foar Arabidopsis en tabak of Gamborg B5 medium foar leverwort.Foar de assay foar remming fan woartelgroei waarden mear dan 10 sieden per plaat siedde op agarmedium mei de oantsjutte ferbiningen as DMSO.Siedingen waarden ynkubeare yn in groeikeamer foar 7 dagen.De seedlings waarden fotografearre en de lingte fan de woartels waard mjitten.Foar Arabidopsis-kiemingsassay waarden 48 sieden per plaat siedde op agarmedium mei 200 μM-ferbining as DMSO.Arabidopsis sieden waarden groeid yn in groei keamer en it oantal germinated seedlings waard teld 7 dagen nei kieming (dag).Foar tabakkiemingsassay waarden 24 sieden per plaat siedde op agarmedium mei 200 μM KAND of DMSO.Tabak sieden waarden groeid yn in groei keamer en it oantal kiemde seedlings waard teld nei 14 dagen.Foar de leverwort groei ynhibysje assay, 9 embryos fan elke plaat waarden plated op agar medium mei de oantsjutte konsintraasjes fan KAND of DMSO en ynkubearre yn in groei keamer foar 14 dagen.
Brûk seedlings kleurde mei 5 mg / ml propidiumjodide (PI) om de organisaasje fan woartelmeristem te visualisearjen.PI-sinjalen waarden beoardiele troch fluoreszensmikroskopie mei in TCS SPE konfokale laser-skennenmikroskoop (Leica Microsystems).
Histochemyske kleuring fan woartels mei β-glucuronidase (GUS) waard útfierd neffens it protokol beskreaun troch Malami en Benfey36.Seedlings waarden oernacht yn 90% aceton fêststeld, kleurde mei 0,5 mg / ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-glucuronic acid yn GUS-buffer foar 1 oere en pleatst yn in hydratisearre chloraldehyde-oplossing.(8 g chloralhydrate, 2 ml wetter en 1 ml glycerol) en waarnommen troch differinsjaal ynterferinsje kontrastmikroskopie mei in Axio Imager M1 mikroskoop (Carl Zeiss).
Roothoeken waarden mjitten op 7-dagen-âlde seedlings dy't groeid op fertikaal pleatste platen.Meitsje de hoeke fan 'e woartel út' e rjochting fan 'e swiertekrêftfektor lykas beskreaun yn stap 6.
De arranzjemint fan kortikale mikrotubules waard beoardiele as beskreaun, mei lytse feroarings oan it protokol 37.Anti-β-tubulin antibody (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) en Alexa Fluor 488-konjugearre anty-mûs IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) waarden brûkt as primêre en sekundêre antykladen by 1: 1000 en 1: 100 dilutions, respektivelik.Fluorescence-ôfbyldings waarden krigen mei in TCS SPE-konfokale laser-skennenmikroskoop (Leica Microsystems).Krij Z-stack-ôfbyldings en meitsje projeksjes fan maksimale yntensiteit neffens de ynstruksjes fan de fabrikant.
HeLa-selproliferaasje-assay waard útfierd mei Cell Counting Kit 8 (Dojindo) neffens de ynstruksjes fan de fabrikant.
De groei fan E. coli DH5α waard analysearre troch it mjitten fan seldichte yn kultuer mei in spektrofotometer by 600 nm (OD600).
Cytoskeletale organisaasje yn transgene BY-2-sellen waard waarnommen mei in fluoreszensmikroskoop útrist mei in CSU-X1 konfokaal skennenapparaat (Yokogawa) en in sCMOS-kamera (Zyla, Andor Technology).Cytoskeletale tichtens waard beoardiele troch ôfbyldingsanalyse, dy't it persintaazje cytoskeletale piksels kwantifisearre ûnder cytoplasmyske piksels yn konfokale ôfbyldings mei ImageJ-software lykas beskreaun38,39.
Om seldea yn BY-2-sellen te detektearjen, waard in aliquot fan 'e selsuspensje ynkubeare mei 0,05% Evans blau foar 10 minuten by keamertemperatuer.Selektyf Evans blauwe kleuring fan deade sellen hinget ôf fan extrusion fan de kleurstof út libbensfetbere sellen troch de yntakt plasma membraan40.Kleurde sellen waarden waarnommen mei in helderfjildmikroskoop (BX53, Olympus).
HeLa-sellen waarden groeid yn DMEM oanfolle mei 10% FBS yn in befochtige incubator by 37 ° C en 5% CO2.Sellen waarden behannele mei 100 μM KAND 11, kumamonamic acid 6, kumamonamide 1, 100 ng / ml colcemid (Gibco), of 100 ng / ml Nocodmaze (Sigma) foar 6 h op 37 ° C.Sellen waarden fêst mei MetOH foar 10 min en dan mei acetate foar 5 min by keamertemperatuer.Fêste sellen waarden ynkubeare mei β-tubulin primêr antykodym (1D4A4, Proteintech: 66240-1) verdund yn 0.5% BSA / PBS foar 2 oeren, 3 kear wosken mei TBST, en dan ynkubeare mei Alexa Fluor goat antibody.4881 oere.- Mûs IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) en 15 ng / ml 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) verdund yn 0,5% BSA / PBS.Nei it waskjen mei TBST trije kear, waarden kleurde sellen waarnommen op in Nikon Eclipse Ti-E omkearde mikroskoop.Ofbyldings waarden opnommen mei in koele Hamamatsu ORCA-R2 CCD-kamera mei MetaMorph-software (Molecular Devices).
Post tiid: Jun-17-2024