De pine nematode is in migrearjende endoparasyt yn karantêne dy't bekend is om swiere ekonomyske ferliezen te feroarsaakjen yn ekosystemen fan pinebosken. De hjoeddeiske stúdzje besjocht de nematicidale aktiviteit fan halogenearre indolen tsjin pine nematoden en har wurkingsmeganisme. De nematicidale aktiviteiten fan 5-iodoindol en avermectine (positive kontrôle) tsjin pine nematoden wiene fergelykber en heech by lege konsintraasjes (10 μg/mL). 5-iodoindol fermindere fruchtberens, reproduktive aktiviteit, embryonale en larvale mortaliteit, en lokomotorysk gedrach. Molekulêre ynteraksjes fan liganden mei ynvertebraat-spesifike glutamaat-gated chloridekanaalreceptors stypje it idee dat 5-iodoindol, lykas avermectine, strak bindt oan 'e aktive side fan' e receptor. 5-iodoindol feroarsake ek ferskate fenotypyske deformaasjes yn nematoden, ynklusyf abnormale orgaanynstoarting/krimp en ferhege fakuolisaasje. Dizze resultaten suggerearje dat fakuolen in rol kinne spylje yn 'e dea troch metylaasje fan nematoden. Wichtich is dat 5-jodoindol net-giftig wie foar beide plantesoarten (koal en radys). Sa lit dizze stúdzje sjen dat it tapassen fan jodoindol ûnder miljeu-omstannichheden ferwelkingsskea fan dennebeammen kontrolearje kin.
De dennehoutnematode (Bursaphelenchus xylophilus) heart ta de dennehoutnematoden (PWN), migrearjende endoparasitêre nematoden dy't bekend binne om slimme ekologyske skea te feroarsaakjen oan denneboskekosystemen1. Dennenweltingsykte (PWD) feroarsake troch de dennehoutnematode wurdt in serieus probleem op ferskate kontininten, ynklusyf Aazje en Europa, en yn Noard-Amearika ferneatiget de nematode yntrodusearre dennesoarten1,2. De efterútgong fan dennebeammen is in grut ekonomysk probleem, en it foarútsjoch op syn wrâldwide fersprieding is soargenwekkend3. De folgjende dennesoarten wurde it meast oanfallen troch de nematode: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii, en Pinus radiata4. De dennehoutnematode is in serieuze sykte dy't dennebeammen binnen wiken of moannen nei ynfeksje deadzje kin. Derneist komme útbraken fan dennehoutnematoden faak foar yn in ferskaat oan ekosystemen, sadat oanhâldende ynfeksjeketens fêststeld binne1.
Bursaphelenchus xylophilus is in kwarantine plant-parasitêre nematode dy't heart ta de superfamylje Aphelenchoidea en klade 102.5. De nematode fiedet him op skimmels en fermannichfâldiget him yn it houtweefsel fan dennebeammen, en ûntjout him ta fjouwer ferskillende larvestadia: L1, L2, L3, L4 en in folwoeksen yndividu1,6. Under omstannichheden fan fiedseltekoart giet de dennenematode oer yn in spesjalisearre larvestadium - dauer, dat syn fektor - de dennebastkever (Monochamus alternatus) - parasitearret en oerdroegen wurdt oan sûne dennebeammen. Yn sûne gastheren migrearje nematoden fluch troch plantweefsels en fiede har op parenchymatyske sellen, wat liedt ta in oantal hypersensitiviteitsreaksjes, ferwelking fan dennebeammen en dea binnen in jier nei ynfeksje1,7,8.
Biologyske bestriding fan dennenematoden is al lang in útdaging, mei karantênemaatregels dy't weromgeane nei de 20e iuw. De hjoeddeiske strategyen foar it bestriden fan dennenematoden omfetsje benammen gemyske behannelingen, ynklusyf houtfumigaasje en ymplantaasje fan nematisiden yn beamstammen. De meast brûkte nematisiden binne avermectine en avermectinebenzoaat, dy't ta de avermectinefamylje hearre. Dizze djoere gemikaliën binne tige effektyf tsjin in protte nematodesoarten en wurde beskôge as miljeufreonlik9. Werhelle gebrûk fan dizze nematisiden wurdt lykwols ferwachte dat se seleksjedruk sille kreëarje dy't hast wis sil liede ta it ûntstean fan resistente dennenematoden, lykas oantoand is foar ferskate ynsektenplagen, lykas Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella en de nematoden Trichostrongylus colubriformis en Ostertagia circumcincta, dy't stadichoan resistinsje tsjin avermectinen hawwe ûntwikkele10,11,12. Dêrom moatte fersetpatroanen regelmjittich bestudearre wurde en nematiciden kontinu screene wurde om alternative, kosten-effektive en miljeufreonlike maatregels te finen om PVD te kontrolearjen. Yn 'e lêste desennia hawwe in oantal auteurs it gebrûk fan plantenekstrakten, essensjele oaljes en flechtige stoffen as nematodekontrôlemiddels foarsteld13,14,15,16.
Wy hawwe koartlyn de nematicidale aktiviteit fan indool, in yntersellulêr en ynterkeninkrykssinjaalmolekule, oantoand yn Caenorhabditis elegans 17. Indool is in wiidferspraat yntrasellulêr sinjaal yn mikrobiële ekology, en kontrolearret ferskate funksjes dy't ynfloed hawwe op mikrobiële fysiology, spoarfoarming, plasmidstabiliteit, medisynresistinsje, biofilmfoarming en virulinsje 18, 19. De aktiviteit fan indool en syn derivaten tsjin oare patogene nematoden is net bestudearre. Yn dizze stúdzje hawwe wy de nematicidale aktiviteit fan 34 indolen tsjin dennenematoden ûndersocht en it wurkingsmeganisme fan 'e machtichste 5-jodoindool ferdúdlike mei help fan mikroskopie, time-lapse-fotografy en molekulêre docking-eksperiminten, en de giftige effekten dêrfan op planten beoardiele mei help fan in siedkiemingstest.
Hege konsintraasjes (>1.0 mM) fan indool binne earder rapportearre as in nematicidal effekt op nematoden17. Nei behanneling fan B. xylophilus (mingde libbensstadia) mei indool of 33 ferskillende indoolderivaten by 1 mM, waard de mortaliteit fan B. xylophilus metten troch it tellen fan libbene en deade nematoden yn 'e kontrôle- en behannele groepen. Fiif indolen lieten wichtige nematicidale aktiviteit sjen; it oerlibjen fan 'e net-behannele kontrôlegroep wie 95 ± 7% nei 24 oeren. Fan 'e 34 testen indolen feroarsaken 5-jodoindool en 4-fluoroindool by 1 mM 100% mortaliteit, wylst 5,6-difluorindigo, methylindool-7-karboksylaat en 7-jodoindool sawat 50% mortaliteit feroarsaken (Tabel 1).
Effekt fan 5-jodoindol op fakuoalfoarming en metabolisme fan dennehoutnematode. (A) Effekt fan avermectine en 5-jodoindol op folwoeksen manlike nematoden, (B) L1-stadium nematode-aaien en (C) metabolisme fan B. xylophilus, (i) fakuoalen waarden net waarnommen nei 0 oeren, behanneling resultearre yn (ii) fakuoalen, (iii) opgarjen fan meardere fakuoalen, (iv) swelling fan fakuoalen, (v) fúzje fan fakuoalen en (vi) foarming fan gigantyske fakuoalen. Reade pylken jouwe swelling fan fakuoalen oan, blauwe pylken jouwe fúzje fan fakuoalen oan en swarte pylken jouwe gigantyske fakuoalen oan. Skaalbalke = 50 μm.
Derneist beskreau dizze stúdzje ek it opienfolgjende proses fan metaan-induzearre dea yn dennenematoden (figuer 4C). Metanogene dea is in net-apoptotyske soarte seldea dy't assosjeare wurdt mei de opgarjen fan promininte cytoplasmatyske fakuoalen27. De morfologyske defekten dy't waarnommen binne yn dennenematoden lykje nau besibbe te wêzen oan it meganisme fan metaan-induzearre dea. Mikroskopysk ûndersyk op ferskate tiden liet sjen dat gigantyske fakuoalen foarme waarden nei 20 oeren bleatstelling oan 5-jodoindole (0,1 mM). Mikroskopyske fakuoalen waarden waarnommen nei 8 oeren behanneling, en har oantal naam ta nei 12 oeren. Ferskate grutte fakuoalen waarden waarnommen nei 14 oeren. Ferskate fusearre fakuoalen wiene dúdlik sichtber nei 12-16 oeren behanneling, wat oanjout dat fakuoalfúzje de basis is fan it metanogene deameganisme. Nei 20 oeren waarden ferskate gigantyske fakuoalen fûn yn 'e wjirm. Dizze waarnimmings fertsjintwurdigje it earste rapport fan metuose yn C. elegans.
Yn wjirms behannele mei 5-jodoindol waarden ek fakuoalaggregaasje en ruptura waarnommen (Fig. 5), lykas bliken docht út it bûgen fan 'e wjirms en it frijkommen fan fakuoalen yn 'e omjouwing. Fakuoalfersteuring waard ek waarnommen yn it aaiskilmembraan, dat normaal yntakt bewarre wurdt troch L2 tidens it útkommen (Oanfoljende Fig. S2). Dizze waarnimmings stypje de belutsenens fan floeistofakkumulaasje en osmoregulatory falen, lykas omkearbere selskade (RCI), yn it proses fan fakuoalfoarming en ettering (Fig. 5).
Mei it hypotetisearjen fan 'e rol fan jodium yn 'e waarnommen fakuoalfoarming, hawwe wy de nematicidale aktiviteit fan natriumjodide (NaI) en kaliumjodide (KI) ûndersocht. By konsintraasjes (0.1, 0.5 of 1 mM) hienen se lykwols gjin ynfloed op it oerlibjen fan nematoden of de fakuoalfoarming (Oanfoljende Fig. S5), hoewol 1 mM KI in licht nematicidal effekt hie. Oan 'e oare kant feroarsake 7-jodoindole (1 of 2 mM), lykas 5-jodoindole, meardere fakuoalen en strukturele deformaasjes (Oanfoljende Fig. S6). De twa jodoindolen lieten ferlykbere fenotypyske skaaimerken sjen yn pine-nematoden, wylst NaI en KI dat net diene. Nijsgjirrich is dat indole gjin fakuoalfoarming feroarsake yn B. xylophilus by de testen konsintraasjes (gegevens net werjûn). Sa befêstigen de resultaten dat it indole-jodiumkompleks ferantwurdlik is foar de fakuolisaasje en metabolisme fan B. xylophilus.
Under de indolen dy't testen binne op nematicidale aktiviteit, hie 5-jodoindol de heechste slip-yndeks fan -5,89 kcal/mol, folge troch 7-jodoindol (-4,48 kcal/mol), 4-fluoroindol (-4,33) en indol (-4,03) (Ofbylding 6). De sterke wetterstofbining yn 'e rêchbonke fan 5-jodoindol oan leucine 218 stabilisearret syn binding, wylst alle oare indolderivaten fia sydketenwetterstofbiningen oan serine 260 bine. Under oare modellearre jodoindolen hat 2-jodoindol in biningswearde fan -5.248 kcal/mol, wat te tankjen is oan syn wichtichste wetterstofbining mei leucine 218. Oare bekende biningen omfetsje 3-jodoindol (-4.3 kcal/mol), 4-jodoindol (-4.0 kcal/mol), en 6-fluoroindol (-2.6 kcal/mol) (Oanfoljende figuer S8). De measte halogenearre indolen en indol sels, mei útsûndering fan 5-jodoindol en 2-jodoindol, foarmje in ferbining mei serine 260. It feit dat wetterstofbining mei leucine 218 oanjout op effisjinte reseptor-ligandbinding, lykas waarnommen foar ivermectine (Oanfoljende Fig. S7), befêstiget dat 5-jodoindol en 2-jodoindol, lykas ivermectine, strak bine oan it aktive plak fan 'e GluCL-reseptor fia leucine 218 (Fig. 6 en Oanfoljende Fig. S8). Wy stelle foar dat dizze binding nedich is om de iepen poarstruktuer fan it GluCL-kompleks te behâlden en dat troch strak te binen oan it aktive plak fan 'e GluCL-reseptor, 5-jodoindol, 2-jodoindol, avermectine en ivermectine sa it ionkanaal iepen hâlde en floeistofopname mooglik meitsje.
Molekulêre docking fan indool en halogenearre indool oan GluCL. Bindingoriïntaasjes fan (A) indool, (B) 4-fluorindool, (C) 7-iodoindool, en (D) 5-iodoindool liganden oan it aktive plak fan GluCL. It proteïne wurdt fertsjintwurdige troch in lint, en de wetterstofbiningen fan 'e rêchbonke wurde werjûn as giele stippele linen. (A′), (B′), (C′), en (D′) litte de ynteraksjes sjen fan 'e oerienkommende liganden mei de omlizzende aminosoerresiduen, en de wetterstofbiningen fan 'e sydketen wurde oanjûn troch rôze stippele pylken.
Eksperiminten waarden útfierd om it giftige effekt fan 5-jodoindol op 'e kimen fan koal- en radyssied te evaluearjen. 5-jodoindol (0,05 of 0,1 mM) of avermectine (10 μg/mL) hie in bytsje of gjin effekt op 'e earste kimen en it opkommen fan plantkes (Ofbylding 7). Derneist waard gjin signifikant ferskil fûn tusken de kimensnelheid fan net-behannele kontrôles en siedden behannele mei 5-jodoindol of avermectine. It effekt op 'e ferlinging fan 'e tapwoartel en it oantal foarme laterale woartels wie ûnbelangryk, hoewol 1 mM (10 kear de aktive konsintraasje) fan 5-jodoindol de ûntwikkeling fan laterale woartels wat fertrage. Dizze resultaten jouwe oan dat 5-jodoindol net-giftig is foar plantsellen en de ûntwikkelingsprosessen fan planten net bemuoit by de bestudearre konsintraasjes.
Effekt fan 5-jodoindol op siedkieming. Kieming, spruiten en laterale woarteling fan B. oleracea en R. raphanistrum siedden op Murashige en Skoog agar medium mei of sûnder avermectine of 5-jodoindol. Kieming waard registrearre nei 3 dagen ynkubaasje by 22°C.
Dizze stúdzje rapportearret ferskate gefallen fan nematode-deadzjen troch indolen. Wichtich is dat dit it earste rapport is fan jodoindol dy't metylaasje feroarsaket (in proses feroarsake troch de opgarjen fan lytse fakuoalen dy't stadichoan oergeane yn gigantyske fakuoalen, wat úteinlik liedt ta membraanbreuk en dea) yn dennenaalden, wêrby't jodoindol wichtige nematicide eigenskippen sjen lit dy't fergelykber binne mei dy fan it kommersjele nematicide avermectine.
Earder is rapportearre dat indolen meardere sinjaalfunksjes útoefenje yn prokaryoten en eukaryoten, ynklusyf biofilm-ynhibysje/foarming, baktearjele oerlibjen en patogeniteit19,32,33,34. Koartlyn hawwe de potinsjele terapeutyske effekten fan halogenearre indolen, indoolalkaloïden en semi-syntetyske indoolderivaten wiidweidige ûndersyksbelangstelling lutsen35,36,37. Bygelyks, halogenearre indolen is oantoand om persistente Escherichia coli- en Staphylococcus aureus-sellen te deadzjen37. Derneist is it fan wittenskiplik belang om de effektiviteit fan halogenearre indolen tsjin oare soarten, geslachten en keninkriken te bestudearjen, en dizze stúdzje is in stap nei it berikken fan dit doel.
Hjir stelle wy in meganisme foar foar 5-jodoindole-induzearre letaliteit yn C. elegans basearre op omkearbere selskade (RCI) en metylaasje (Figuren 4C en 5). Oedemateuze feroarings lykas wallen en fakuolêre degeneraasje binne yndikatoaren fan RCI en metylaasje, manifestearre as gigantyske fakuoalen yn it cytoplasma48,49. RCI bemuoit him mei enerzjyproduksje troch ATP-produksje te ferminderjen, wêrtroch't de ATPase-pomp mislearret, of selmembranen fersteurt en in rappe ynstream fan Na+, Ca2+ en wetter feroarsaket50,51,52. Intracytoplasmatyske fakuoalen ûntsteane yn dierzellen as gefolch fan floeistofophoping yn it cytoplasma fanwegen de ynstream fan Ca2+ en wetter53. Nijsgjirrich is dat dit meganisme fan selskade omkearber is as de skea tydlik is en de sellen foar in bepaalde perioade ATP begjinne te produsearjen, mar as de skea oanhâldt of fergruttet, stjerre de sellen.54 Us waarnimmings litte sjen dat nematoden behannele mei 5-jodoindol net yn steat binne om normale biosynteze te herstellen nei bleatstelling oan stressomstannichheden.
It metylaasjefenotype dat feroarsake wurdt troch 5-jodoindole yn B. xylophilus kin te tankjen wêze oan 'e oanwêzigens fan jodium en syn molekulêre ferdieling, om't 7-jodoindole minder remmende effekt hie op B. xylophilus as 5-jodoindole (Tabel 1 en Oanfoljende Figuer S6). Dizze resultaten binne foar in part yn oerienstimming mei de stúdzjes fan Maltese et al. (2014), dy't rapportearren dat translokaasje fan 'e pyridylstikstofgroep yn indole fan 'e para- nei de meta-posysje fakuolisaasje, groei-ynhibysje en cytotoxiciteit yn U251-sellen ôfskafte, wat suggerearret dat de ynteraksje fan it molekule mei in spesifike aktive side yn it proteïne kritysk is27,44,45. De ynteraksjes tusken indole of halogenearre indoles en GluCL-receptors dy't yn dizze stúdzje waarnommen binne, stypje ek dizze opfetting, om't 5- en 2-jodoindole sterker oan GluCL-receptors bine as de oare ûndersochte indoles (Figuer 6 en Oanfoljende Figuer S8). It jodium op 'e twadde of fyfde posysje fan 'e indool die bliken te binen oan leucine 218 fan 'e GluCL-reseptor fia rêchbonkewetterstofbiningen, wylst oare halogeenearre indolen en indool sels swakke sydketenwetterstofbiningen foarmje mei serine 260 (Ofbylding 6). Wy spekulearje dêrom dat de lokalisaasje fan 'e halogeen in wichtige rol spilet yn 'e ynduksje fan fakuolêre degeneraasje, wylst de strakke bining fan 5-jodoindool it ionkanaal iepen hâldt, wêrtroch't rappe floeistofynstream en fakuoalbreuk mooglik binne. It detaillearre wurkingsmeganisme fan 5-jodoindool moat lykwols noch bepaald wurde.
Foardat 5-jodoindol yn 'e praktyk tapast wurdt, moat it giftige effekt op planten analysearre wurde. Us siedkiemingseksperiminten lieten sjen dat 5-jodoindol gjin negatyf effekt hie op siedkieming of lettere ûntwikkelingsprosessen by de bestudearre konsintraasjes (Ofbylding 7). Sa biedt dizze stúdzje in basis foar it gebrûk fan 5-jodoindol yn 'e ekologyske omjouwing om de skealikens fan dennenematoden foar dennebeammen te kontrolearjen.
Eardere rapporten hawwe oantoand dat indole-basearre terapy in potinsjele oanpak foarmet om it probleem fan antibiotikaresistinsje en kankerprogresje oan te pakken55. Derneist hawwe indolen antibakteriële, antykanker-, antioxidant-, anty-inflammatoire, antidiabetyske, antivirale, antiproliferative en antituberkuloaze-aktiviteiten en kinne se tsjinje as in beloftefolle basis foar medisynûntwikkeling56,57. Dizze stúdzje suggerearret foar it earst it potinsjele gebrûk fan jodium as in antiparasitêr en anthelmintisk middel.
Avermectin waard trije desennia lyn ûntdutsen en wûn de Nobelpriis yn 2015, en it gebrûk as anthelmintikum is noch altyd aktyf oan 'e gong. Fanwegen de rappe ûntwikkeling fan ferset tsjin avermectinen yn nematoden en ynsektenplagen is lykwols in alternative, goedkeape en miljeufreonlike strategy nedich om PWN-ynfeksje yn dennebeammen te kontrolearjen. Dizze stúdzje rapportearret ek it meganisme wêrmei't 5-iodoindol dennenematoden deadet en dat 5-iodoindol lege toksisiteit hat foar plantsellen, wat goede perspektiven iepenet foar syn takomstige kommersjele tapassing.
Alle eksperiminten waarden goedkard troch de Etyske Kommisje fan 'e Universiteit fan Yeungnam, Gyeongsan, Korea, en de metoaden waarden útfierd yn oerienstimming mei de rjochtlinen fan 'e Etyske Kommisje fan 'e Universiteit fan Yeungnam.
Aai-ynkubaasje-eksperiminten waarden útfierd mei fêststelde prosedueres43. Om útbroedsifers (HR) te beoardieljen, waarden 1-dei âlde folwoeksen nematoden (sawat 100 wyfkes en 100 mantsjes) oerbrocht nei petriskûtels mei de skimmel en 24 oeren groeie litten. De aaien waarden doe isolearre en behannele mei 5-jodoindol (0,05 mM en 0,1 mM) of avermectine (10 μg/ml) as in suspensje yn steryl destillearre wetter. Dizze suspensjes (500 μl; sawat 100 aaien) waarden oerbrocht nei de putten fan in weefselkweekplaat mei 24 putten en ynkubearre by 22 °C. L2-tellingen waarden makke nei 24 oeren ynkubaasje, mar waarden as dea beskôge as de sellen net beweegden doe't se stimulearre waarden mei in tinne platina tried. Dit eksperimint waard útfierd yn twa stadia, elk mei seis werhellingen. De gegevens fan beide eksperiminten waarden kombineare en presintearre. It persintaazje HR wurdt as folget berekkene:
Larvale mortaliteit waard beoardiele mei earder ûntwikkele prosedueres. Nematode-aaien waarden sammele en embryo's waarden syngronisearre troch útbroeien yn steryl destillearre wetter om larven yn it L2-stadium te generearjen. Syngronisearre larven (sawat 500 nematoden) waarden behannele mei 5-jodoindol (0,05 mM en 0,1 mM) of avermectine (10 μg/ml) en grutbrocht op B. cinerea Petri-platen. Nei 48 oeren ynkubaasje by 22 °C waarden nematoden sammele yn steryl destillearre wetter en ûndersocht op 'e oanwêzigens fan L2-, L3- en L4-stadia. De oanwêzigens fan L3- en L4-stadia joech larvale transformaasje oan, wylst de oanwêzigens fan it L2-stadium gjin transformaasje oanjûn. Ofbyldings waarden makke mei it iRiS™ Digital Cell Imaging System. Dit eksperimint waard útfierd yn twa stadia, elk mei seis werhellingen. De gegevens fan beide eksperiminten waarden kombineare en presintearre.
De toksisiteit fan 5-jodoindol en avermectine foar siedden waard beoardiele mei help fan kimtests op Murashige en Skoog agarplaten.62 B. oleracea en R. raphanistrum siedden waarden earst ien dei yn steryl destillearre wetter wekke, wosken mei 1 ml 100% ethanol, sterilisearre mei 1 ml 50% kommersjele bleekmiddel (3% natriumhypochloriet) foar 15 minuten, en fiif kear wosken mei 1 ml steryl wetter. De sterilisearre siedden waarden doe op kimplatten parse mei 0,86 g/l (0,2X) Murashige en Skoog medium en 0,7% bakteriologyske agar mei of sûnder 5-jodoindol of avermectine. De platen waarden doe ynkubearre by 22 °C, en ôfbyldings waarden makke nei 3 dagen ynkubaasje. Dit eksperimint waard útfierd yn twa stadia, elk mei seis werhellingen.
Pleatsingstiid: 26 febrewaris 2025