Shoot apical meristem (SAM) groei is kritysk foar stam arsjitektuer. Plant hormonengibberellins(GA's) spylje wichtige rollen yn it koördinearjen fan plantgroei, mar har rol yn 'e SAM bliuwt min begrepen. Hjir hawwe wy in ratiometryske biosensor fan GA-sinjalearring ûntwikkele troch it DELLA-proteïne te manipulearjen om syn essensjele regeljende funksje te ûnderdrukken yn 'e GA-transkripsje-antwurd, wylst syn degradaasje behâlde by GA-erkenning. Wy litte sjen dat dizze degradaasje-basearre biosensor wizigingen yn GA-nivo's en sellulêre sensing sekuer registrearret tidens ûntwikkeling. Wy brûkten dizze biosensor om GA-sinjaalaktiviteit yn 'e SAM yn kaart te bringen. Wy litte sjen dat hege GA-sinjalen foaral oanwêzich binne yn sellen dy't lizze tusken orgaanprimordia, dy't foarrinners binne foar ynternoade-sellen. Mei help fan winst- en ferlies-fan-funksje oanpak, bewize wy fierder dat GA regelet de oriïntaasje fan it sel divyzje fleantúch, it fêststellen fan de kanonike sellulêre organisaasje fan internodes, dêrmei it befoarderjen fan internode spesifikaasje yn de SAM.
De shoot apical meristem (SAM), leit oan 'e shoot apex, befettet in niche fan stamsellen waans aktiviteit generearret laterale organen en stam knopen yn in modulêre en iterative wize troch it libben fan de plant. Elk fan dizze werheljende ienheden, of plantknooppunten, omfettet ynternoden en laterale organen oan 'e knopen, en okselmeristemen yn' e blêdoksels1. De groei en organisaasje fan plantknooppunten feroaret tidens ûntwikkeling. Yn Arabidopsis wurdt ynternodale groei ûnderdrukt yn 'e fegetative poadium, en axillêre meristemen bliuwe sliepend yn' e oksels fan rosetteblêden. Tidens de oergong nei de florale faze, de SAM wurdt de bloeiens meristem, generearje langwerpige internodes en axillary knoppen, tûken yn 'e oksels fan cauline blêden, en letter, leafless blommen2. Hoewol wy wichtige foarútgong hawwe makke yn it begripen fan 'e meganismen dy't it ynisjearjen fan blêden, blommen en tûken kontrolearje, is relatyf lyts bekend oer hoe't ynternoden ûntsteane.
Begryp fan 'e spatiotemporale ferdieling fan GA's sil helpe om de funksjes fan dizze hormonen better te begripen yn ferskate weefsels en yn ferskate ûntwikkelingsstadia. Fisualisaasje fan 'e degradaasje fan RGA-GFP-fúzje útdrukt ûnder de aksje fan har eigen promotor jout wichtige ynformaasje oer de regeling fan totale GA-nivo's yn woartels15,16. RGA-ekspresje ferskilt lykwols oer tissue17 en wurdt regele troch GA18. Sa kin differinsjaal ekspresje fan 'e RGA-promotor resultearje yn it fluoreszenspatroan dat wurdt waarnommen mei RGA-GFP en dus is dizze metoade net kwantitatyf. Mear resint iepenbiere bioaktyf fluoresceïne (Fl)-markearre GA19,20 de accumulation fan GA yn 'e root-endocortex en de regeling fan har sellulêre nivo's troch GA-transport. Koartlyn liet de GA FRET-sensor nlsGPS1 sjen dat GA-nivo's korrelearje mei selferlinging yn woartels, filaminten en donkere groeide hypocotylen21. Lykas wy hawwe sjoen, is GA-konsintraasje lykwols net de ienige parameter dy't GA-sinjaalaktiviteit kontrolearret, om't it hinget fan komplekse sensingprosessen. Hjir, bouwend op ús begryp fan 'e DELLA- en GA-sinjalearpaden, rapportearje wy de ûntwikkeling en karakterisaasje fan in degradaasje-basearre ratiometryske biosensor foar GA-sinjalearring. Om dizze kwantitative biosensor te ûntwikkeljen, brûkten wy in mutant GA-gefoelige RGA dy't fusearre waard oan in fluorescent proteïne en ubiquitously útdrukt yn weefsels, lykas ek in GA-ûngefoelige fluorescent proteïne. Wy litte sjen dat de mutante RGA-proteinfúzjes net ynterferearje mei endogene GA-sinjalearring as ubiquitously útdrukt wurde, en dat dizze biosensor sinjaalaktiviteit kin kwantifisearje as gefolch fan sawol GA-ynput as GA-sinjaalferwurking troch it sensingapparaat mei hege spatiotemporale resolúsje. Wy brûkten dizze biosensor om de spatiotemporale ferdieling fan GA-sinjaalaktiviteit yn kaart te bringen en te kwantifisearjen hoe't GA sellulêr gedrach yn 'e SAM-epidermis regelet. Wy litte sjen dat GA de oriïntaasje fan it divyzjeflak fan SAM-sellen regelet tusken orgaanprimordia, en definiearret dêrmei de kanonike sellulêre organisaasje fan 'e internode.
Uteinlik fregen wy oft qmRGA feroaringen yn endogene GA-nivo's koe rapportearje mei groeiende hypocotylen. Wy hawwe earder oantoand dat nitraat groei stimulearret troch it fergrutsjen fan GA-synteze en, op syn beurt, DELLA34-degradaasje. Dêrfandinne, wy observearre dat hypocotyl lingte yn pUBQ10 :: qmRGA seedlings groeid ûnder oerfloedich nitraat oanbod (10 mM NO3-) wie signifikant langer as dat yn seedlings groeid ûnder nitraat-deficient omstannichheden (oanfoljende Fig. 6a). Yn oerienstimming mei de groei antwurd, GA sinjalen wiene heger yn hypocotylen fan seedlings groeid ûnder 10 mM NO3- betingsten as yn seedlings groeid yn it ûntbrekken fan nitraat (Supplementary Fig. 6b, c). Sa makket qmRGA ek tafersjoch op feroaringen yn GA-sinjalearring mooglik feroarsake troch endogene feroaringen yn GA-konsintraasje.
Om te begripen oft de GA-sinjalearjende aktiviteit ûntdutsen troch qmRGA hinget ôf fan GA-konsintraasje en GA-persepsje, lykas ferwachte basearre op it sensorûntwerp, analysearren wy de ekspresje fan 'e trije GID1-receptors yn fegetative en reproduktive weefsels. Yn seedlings liet de GID1-GUS reporterline sjen dat GID1a en c tige útdrukt waarden yn cotyledons (fig. 3a-c). Dêrnjonken waarden alle trije receptors útdrukt yn blêden, laterale root primordia, root tips (útsein foar de root cap fan GID1b), en it vaskulêre systeem (Fig. 3a-c). Yn 'e bloeiens SAM ûntdutsen wy GUS-sinjalen allinich foar GID1b en 1c (Supplementary Fig. 7a-c). In situ hybridisaasje befêstige dizze ekspresjepatroanen en demonstrearre fierder dat GID1c unifoarm útdrukt waard op lege nivo's yn 'e SAM, wylst GID1b hegere ekspresje oan' e perifery fan 'e SAM toande (oanfoljende Fig. 7d-l). De translaasjefúzje fan pGID1b :: 2xmTQ2-GID1b liet ek in gradearre berik fan GID1b-ekspresje sjen, fan leech of gjin ekspresje yn it sintrum fan 'e SAM oant hege ekspresje by de oargelgrinzen (Supplementary Fig. 7m). Sa wurde GID1-receptors net unifoarm ferdield oer en binnen weefsels. Yn folgjende eksperiminten hawwe wy ek observearre dat oerekspresje fan GID1 (pUBQ10 :: GID1a-mCherry) de gefoelichheid fan qmRGA yn hypocotylen ta eksterne GA-applikaasje fergrutte (figuer 3d, e). Yn tsjinstelling, fluorescence mjitten troch qd17mRGA yn de hypocotyl wie ûnsensitive foar GA3 behanneling (Fig. 3f, g). Foar beide assays waarden seedlings behannele mei hege konsintraasjes fan GA (100 μM GA3) om it rappe gedrach fan 'e sensor te beoardieljen, wêr't de mooglikheid om te binen oan' e GID1-receptor waard fersterke of ferlern. Mei-elkoar befêstigje dizze resultaten dat de qmRGA-biosensor in kombineare funksje tsjinnet as GA- en GA-sensor, en suggerearje dat differinsjaal ekspresje fan 'e GID1-receptor de emissiviteit fan' e sensor signifikant kin modulearje.
Oant no ta bliuwt de ferdieling fan GA-sinjalen yn 'e SAM ûndúdlik. Dêrom, wy brûkten qmRGA-ekspresje planten en de pCLV3 :: mCherry-NLS stamsel reporter35 te berekkenjen hege-resolúsje kwantitative kaarten fan GA sinjalearjen aktiviteit, rjochte op de L1 laach (epidermis; Fig. 4a, b, sjoch Metoaden en Oanfoljende Metoaden), sûnt L1 spilet in wichtige rol yn groei fan SAM36. Hjir, pCLV3 :: mCherry-NLS-ekspresje joech in fêst geometrysk referinsjepunt foar it analysearjen fan de spatiotemporale ferdieling fan GA-sinjaalaktiviteit37. Hoewol GA wurdt beskôge as essensjeel foar laterale oargelûntwikkeling4, hawwe wy observearre dat GA-sinjalen leech wiene yn 'e florale primordium (P) begjinnend fan' e P3-poadium (Fig. 4a, b), wylst jonge P1- en P2-primordiums matige aktiviteit hienen fergelykber mei dy yn 'e sintrale regio (Fig. 4a, b). Hegere GA-sinjalearjende aktiviteit waard ûntdutsen by de oargel primordium grinzen, begjinnend by P1 / P2 (oan 'e kanten fan' e grins) en peaking by P4, likegoed as yn alle sellen fan 'e perifeare regio leit tusken de primordia (Fig. 4a, b en Supplementary Fig. 8a, b). Dizze hegere GA-sinjalearjende aktiviteit waard net allinich yn 'e epidermis beoardield, mar ek yn' e L2- en boppeste L3-lagen (Supplementary Fig. 8b). It patroan fan GA-sinjalen ûntdutsen yn 'e SAM mei qmRGA bleau ek net feroare oer de tiid (oanfoljende Fig. 8c-f, k). Hoewol it qd17mRGA-konstruksje systematysk yn 'e SAM fan T3-planten ôfregulearre waard fan fiif ûnôfhinklike rigels dy't wy yn detail karakterisearre, koenen wy de fluoreszenspatroanen analysearje dy't krigen waarden mei it pRPS5a :: VENUS-2A-TagBFP-konstruksje (Supplementary Fig. 8g-j, l). Yn dizze kontrôleline waarden allinich lytse feroaringen yn 'e fluoreszensferhâlding yn' e SAM ûntdutsen, mar yn 'e SAM-sintrum hawwe wy in dúdlike en ûnferwachte fermindering fan VENUS yn ferbân brocht mei TagBFP. Dit befêstiget dat it sinjalearjen patroan waarnommen troch qmRGA wjerspegelet GA-ôfhinklike degradaasje fan mRGA-VENUS, mar ek docht bliken dat qmRGA kin overestimate GA sinjaalaktiviteit yn it meristem sintrum. Gearfetsjend litte ús resultaten in GA-sinjaalpatroan sjen dat primêr de ferdieling fan primordia wjerspegelet. Dizze ferdieling fan 'e inter-primordiale regio (IPR) is troch it stadichoan fêstigjen fan hege GA-sinjalearjende aktiviteit tusken it ûntwikkeljen primordium en de sintrale regio, wylst tagelyk GA-sinjalearjende aktiviteit yn' e primordium ôfnimt (Fig. 4c, d).
De ferdieling fan GID1b- en GID1c-receptors (sjoch hjirboppe) suggerearret dat differinsjaal ekspresje fan GA-receptors helpt by it foarmjen fan it patroan fan GA-sinjaalaktiviteit yn 'e SAM. Wy fregen ús ôf oft differinsjaal accumulation fan GA kin wêze belutsen. Om dizze mooglikheid te ûndersykjen, brûkten wy de nlsGPS1 GA FRET sensor21. Ferhege aktivearringsfrekwinsje waard ûntdutsen yn 'e SAM fan nlsGPS1 behannele mei 10 μM GA4 + 7 foar 100 min (Supplementary Fig. 9a-e), wat oanjout dat nlsGPS1 reagearret op feroaringen yn GA-konsintraasje yn 'e SAM, lykas it docht yn roots21. Romtlike ferdieling fan nlsGPS1 aktivearring frekwinsje iepenbiere relatyf lege GA nivo yn 'e bûtenste lagen fan' e SAM, mar die bliken dat se waarden ferhege yn it sintrum en oan 'e grinzen fan' e SAM (Fig. 4e en Oanfoljende Fig. 9a, c). Dit suggerearret dat GA ek wurdt ferdield yn de SAM mei in romtlike patroan te fergelykjen mei dat iepenbiere troch qmRGA. As komplementêre oanpak hawwe wy de SAM ek behannele mei fluorescent GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) of Fl allinich as in negative kontrôle. It Fl-sinjaal waard ferspraat oer de SAM, ynklusyf de sintrale regio en primordium, hoewol op in legere yntensiteit (Fig. 4j en Supplementary Fig. 10d). Yn tsjinstelling ta sammele alle trije GA-Fl spesifyk binnen de primordiumgrinzen en yn ferskate graden yn 'e rest fan' e IPR, mei GA7-Fl sammele yn 'e grutste domein yn' e IPR (Fig. 4k en Supplementary Fig. 10a, b). Kwantifikaasje fan fluorescence-yntensiteit die bliken dat de IPR oant net-IPR-yntensiteitsferhâlding heger wie yn GA-Fl-behannele SAM yn ferliking mei Fl-behannele SAM (Fig. 4l en Supplementary Fig. 10c). Mei-elkoar suggerearje dizze resultaten dat GA oanwêzich is by hegere konsintraasjes yn IPR-sellen dy't it tichtst by de oargelgrins lizze. Dit suggerearret dat it patroan fan SAM GA-sinjalearjende aktiviteit resultaat is fan sawol differinsjaal ekspresje fan GA-receptors as differinsjaal accumulation fan GA yn IPR-sellen tichtby oargelgrinzen. Sa liet ús analyse in ûnferwachte spatiotemporale patroan fan GA-sinjalearring sjen, mei legere aktiviteit yn it sintrum en primordium fan 'e SAM en hegere aktiviteit yn' e IPR yn 'e perifeare regio.
Om de rol fan differinsjaal GA-sinjalearjen yn 'e SAM te begripen, analysearren wy de korrelaasje tusken GA-sinjalearjende aktiviteit, sel-útwreiding en seldieling mei real-time time-lapse-ôfbylding fan' e SAM qmRGA pCLV3 :: mCherry-NLS. Sjoen de rol fan GA yn groeiregeling, waard in positive korrelaasje mei parameters foar sellenútwreiding ferwachte. Dêrom fergelike wy earst GA-sinjalearaktiviteitskaarten mei kaarten fan sel oerflak groei rate (as proxy foar de sterkte fan sel útwreiding foar in opjûne sel en foar dochter sellen by divyzje) en mei kaarten fan groei anisotropy, dy't mjit de rjochting fan sel útwreiding (ek brûkt hjir foar in opjûne sel en foar dochter sellen by divyzje; Fig. 5a, b, sjoch metoaden en oanfoljende metoaden). Us kaarten fan SAM sel oerflak groei taryf binne yn oerienstimming mei eardere observaasjes38,39, mei minimale groei tariven by de grins en maksimale groei tariven yn it ûntwikkeljen fan blommen (Fig. 5a). Principal component analysis (PCA) liet sjen dat GA-sinjalearjende aktiviteit negatyf korrelearre wie mei selle-oerflakgroeiintensiteit (figuer 5c). Wy lieten ek sjen dat de wichtichste assen fan fariaasje, ynklusyf GA-sinjalearjen ynput en groeiintensiteit, orthogonaal wiene oan 'e rjochting bepaald troch hege CLV3-ekspresje, befêstigje de útsluting fan sellen út it SAM-sintrum yn' e oerbleaune analyzes. Spearman-korrelaasje-analyse befêstige de PCA-resultaten (figuer 5d), wat oanjout dat hegere GA-sinjalen yn 'e IPR net resultearre yn hegere sel-útwreiding. Korrelaasje-analyze liet lykwols in lichte positive korrelaasje sjen tusken GA-sinjaalaktiviteit en groeianisotropy (figuer 5c, d), wat suggerearret dat hegere GA-sinjalearring yn 'e IPR de rjochting fan selgroei beynfloedet en mooglik de posysje fan it seldielingsfleantúch.
a, b Heat kaarten fan gemiddelde oerflak groei (a) en groei anisotropy (b) yn SAM gemiddelde oer sân ûnôfhinklike planten (brûkt as proxies foar respektivelik de sterkte en rjochting fan sel útwreiding). c PCA-analyse befette de folgjende fariabelen: GA-sinjaal, oerflakgroeiintensiteit, oerflakgroeianisotropy, en CLV3-ekspresje. PCA-komponint 1 wie benammen negatyf korrelearre mei oerflakgroeiintensiteit en posityf korrelearre mei GA-sinjaal. PCA-komponint 2 wie benammen posityf korrelearre mei oerflak groei anisotropy en negatyf korrelearre mei CLV3 ekspresje. Persintaazjes fertsjintwurdigje de fariaasje útlein troch elke komponint. d Spearman korrelaasje analyze tusken GA sinjaal, oerflak groei yntinsiteit, en oerflak groei anisotropy op 'e weefsel skaal útsein CZ. It nûmer oan de rjochterkant is de Spearman rho wearde tusken twa fariabelen. Asterisken jouwe gefallen oan wêr't de korrelaasje / negative korrelaasje heul signifikant is. e 3D fisualisaasje fan Col-0 SAM L1 sellen troch konfokale mikroskopy. Nije selmuorren foarme yn 'e SAM (mar net it primordium) op 10 h binne kleurd neffens har hoekwearden. De kleurbalke wurdt yn 'e rjochter ûnderhoeke werjûn. De ynset toant de oerienkommende 3D-ôfbylding op 0 h. It eksperimint waard twa kear werhelle mei ferlykbere resultaten. f Box plots werjaan sel divyzje tariven yn IPR en non-IPR Col-0 SAM (n = 10 ûnôfhinklike planten). De middenline toant de mediaan, en de fakgrinzen jouwe de 25e en 75e percentiles oan. Whiskers jouwe de minimale en maksimale wearden oan dy't bepaald binne mei R-software. P-wearden waarden krigen mei Welch's twa-tailed t-test. g, h Skematysk diagram mei (g) hoe't jo de hoeke fan 'e nije selmuorre (magenta) mjitte mei respekt foar de radiale rjochting fan it sintrum fan' e SAM (wite stippelline) (allinich skerpe hoekwearden, dat wol sizze, 0-90 °, wurde beskôge), en (h) de circumferential / lateraal en radiale rjochtingen binnen it meristeem. i Frekwinsje histograms fan sel divyzje fleanmasine oriïntaasje oer de SAM (donkerblau), IPR (medium blau), en net-IPR (ljocht blau), respektivelik. P-wearden waarden krigen troch in twa-tailed Kolmogorov-Smirnov test. It eksperimint waard twa kear werhelle mei ferlykbere resultaten. j Frekwinsje histograms fan sel divyzje fleanmasine oriïntaasje fan de IPR om P3 (ljocht grien), P4 (medium grien), en P5 (donkergrien), respektivelik. P-wearden waarden krigen troch in twa-tailed Kolmogorov-Smirnov test. It eksperimint waard twa kear werhelle mei ferlykbere resultaten.
Dêrom ûndersochten wy neist de korrelaasje tusken GA-sinjalearjen en seldielingaktiviteit troch it identifisearjen fan nij foarme selwanden tidens de assay (Fig. 5e). Dizze oanpak liet ús de frekwinsje en rjochting fan seldieling mjitte. Ferrassend fûnen wy dat de frekwinsje fan seldielingen yn 'e IPR en de rest fan' e SAM (non-IPR, Fig. 5f) fergelykber wie, wat oanjout dat ferskillen yn GA-sinjalearjen tusken IPR en net-IPR-sellen gjin signifikant ynfloed hawwe op seldieling. Dit, en de positive korrelaasje tusken GA-sinjalearring en groeianisotropy, brochten ús om te beskôgjen oft GA-sinjalearaktiviteit de oriïntaasje fan it seldielingsfleantúch koe beynfloedzje. Wy mjitten de oriïntaasje fan 'e nije selmuorre as in skerpe hoeke relatyf oan' e radiale as dy't it meristemsintrum en it sintrum fan 'e nije selmuorre ferbynt (Fig. 5e-i) en observearre in dúdlike oanstriid foar sellen om te dielen yn hoeken tichtby 90 ° relatyf oan 'e radiale as, mei de heechste frekwinsjes beoardiele op 8 ° 090. (22,62%) (fig. 5e, i), oerienkommende mei sel divyzjes yn 'e circumferential / transverse rjochting (figuer 5h). Om de bydrage fan GA-sinjalearjen te ûndersiikjen oan dit seldielingsgedrach, analysearren wy seldielingparameters yn 'e IPR en net-IPR apart (fig. 5i). Wy observearre dat de ferdieling fan 'e hoeke fan' e divyzje yn IPR-sellen ferskille fan dy yn net-IPR-sellen as yn sellen yn 'e hiele SAM, mei IPR-sellen dy't in hegere oanpart fan laterale / sirkulêre seldielingen eksposearje, ie, 70-80 ° en 80-90 ° (33.86% en 30.71%, respektivelik 5, oerienkommende proporsjes) (Fig. Sa lieten ús beoardielingen in assosjaasje sjen tusken hege GA-sinjalearring en in oriïntaasje fan in seldielingsfleantúch tichtby de rûnte rjochting, fergelykber mei de korrelaasje tusken GA-sinjalearjende aktiviteit en groeianisotropy (fig. 5c, d). Om de romtlike behâld fan dizze feriening fierder te fêstigjen, mjitten wy de oriïntaasje fan it divyzjefleanmasine yn IPR-sellen om it primordium te begjinnen fanôf P3, sûnt de heechste GA-sinjalearjende aktiviteit waard ûntdutsen yn dizze regio fanôf P4 (fig. 4). De divyzjewinkels fan 'e IPR om P3 en P4 lieten gjin statistysk signifikante ferskillen sjen, hoewol in ferhege frekwinsje fan laterale seldielingen waard waarnommen yn' e IPR om P4 (fig. 5j). Yn 'e IPR-sellen om P5 hinne waard lykwols it ferskil yn' e oriïntaasje fan 'e seldielingsfleantúch statistysk signifikant, mei in skerpe ferheging fan' e frekwinsje fan transversale seldielingen (fig. 5j). Mei-elkoar suggerearje dizze resultaten dat GA-sinjalearring de oriïntaasje fan seldielingen yn 'e SAM kin kontrolearje, wat oerienkomt mei eardere rapporten40,41 dat hege GA-sinjalearring laterale oriïntaasje fan seldielingen yn' e IPR kin inducearje.
It wurdt foarsein dat sellen yn 'e IPR net sille wurde opnommen yn primordia, mar earder yn internodes2,42,43. De transversale oriïntaasje fan seldielingen yn 'e IPR kin resultearje yn' e typyske organisaasje fan parallelle longitudinale rigen fan epidermale sellen yn ynternoden. Us hjirboppe beskreaune observaasjes suggerearje dat GA-sinjalearring wierskynlik in rol spilet yn dit proses troch de rjochting fan seldieling te regeljen.
Ferlies fan funksje fan ferskate DELLA-genen resultearret yn in konstitutyf GA-antwurd, en della-mutanten kinne brûkt wurde om dizze hypoteze te testen44. Wy analysearren earst de ekspresjepatroanen fan fiif DELLA-genen yn 'e SAM. Transkripsjonele fúzje fan 'e GUS-line45 die bliken dat GAI, RGA, RGL1 en RGL2 (yn in folle mindere mjitte) útdrukt waarden yn' e SAM (Supplementary Fig. 11a-d). In situ hybridisaasje hat fierder oantoand dat GAI mRNA spesifyk accumulearret yn primordia en ûntwikkeljende blommen (Supplementary Fig. 11e). RGL1- en RGL3-mRNA waarden ûntdutsen yn 'e SAM-kap en yn âldere blommen, wylst RGL2-mRNA mear oerfloedich wie yn' e grinsregio (Supplementary Fig. 11f-h). Konfokale ôfbylding fan pRGL3 :: RGL3-GFP SAM befêstige de ekspresje beoardiele troch in situ hybridisaasje en liet sjen dat RGL3-proteïne accumulearret yn it sintrale diel fan 'e SAM (Supplementary Fig. 11i). Mei help fan de line pRGA :: GFP-RGA, wy ek fûn dat RGA aaiwyt accumulearret yn de SAM, mar syn oerfloed nimt ôf by de grins begjinnend fan P4 (Supplementary Fig. 11j). Opmerklik binne de ekspresjepatroanen fan RGL3 en RGA konsistint mei hegere GA-sinjalearjende aktiviteit yn 'e IPR, lykas ûntdutsen troch qmRGA (fig. 4). Boppedat jouwe dizze gegevens oan dat alle DELLA's wurde útdrukt yn 'e SAM en dat har ekspresje kollektyf de heule SAM omspant.
Wy analysearre folgjende de sel divyzje parameters yn de wylde type SAM (Ler, kontrôle) en de gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (globale) mutanten (fig. 6a, b). Nijsgjirrich, wy observearre in statistysk signifikante ferskowing yn de ferdieling fan sel divyzje hoek frekwinsjes yn de della globale mutant SAM ferlike mei de wylde type (figuer 6c). Dizze feroaring yn 'e della globale mutant wie te tankjen oan in tanimming fan' e frekwinsje fan 80-90 ° hoeken (34,71% vs. 24,55%) en, yn mindere mjitte, 70-80 ° hoeken (23,78% vs. 20,18%), ie, oerienkommende mei transverse sel divyzjes (Fig. 6c). De frekwinsje fan net-dwarsôfdielingen (0-60 °) wie ek leger yn 'e della globale mutant (fig. 6c). De frekwinsje fan transversale seldielingen waard signifikant ferhege yn 'e SAM fan' e della globale mutant (fig. 6b). De frekwinsje fan transversale seldielingen yn 'e IPR wie ek heger yn' e della globale mutant yn ferliking mei it wylde type (fig. 6d). Bûten de IPR-regio hie it wylde type in mear unifoarme ferdieling fan seldielingshoeken, wylst de della globale mutant foarkar tangentiale divyzjes lykas de IPR (fig. 6e). Wy kwantifisearje ek de oriïntaasje fan seldielingen yn 'e SAM fan ga2 oxidase (ga2ox) quintuple mutanten (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1, en ga2ox6-2), in GA-ynaktive mutante eftergrûn wêryn GA accumulearret. Yn oerienstimming mei de ferheging fan GA-nivo's wie de SAM fan 'e fiiffâldige ga2ox-mutante bloeiwize grutter as dy fan Col-0 (Supplementary Fig. 12a, b), en yn ferliking mei Col-0, toande de fiiffâldige ga2ox SAM in dúdlik oare ferdieling fan seldielingshoeken, mei de hoeke 500°-frekwinsje oant wer tanimmend fan 9,°-frekwinsje. divyzjes (oanfoljende figuer 12a–c). Sa litte wy sjen dat konstitutive aktivearring fan GA-sinjalearring en GA-akkumulaasje laterale seldielingen yn 'e IPR en de rest fan' e SAM induce.
a, b 3D fisualisaasje fan de L1 laach fan PI-bevlekte Ler (in) en globale della mutant (b) SAM mei help confocal mikroskopy. Nije selmuorren foarme yn 'e SAM (mar net it primordium) oer in perioade fan 10 oeren wurde toand en kleure neffens har hoekwearden. It ynset toant de SAM op 0 h. De kleurbalke wurdt werjûn yn 'e rjochter ûnderhoeke. De pylk yn (b) wiist nei in foarbyld fan ôfstimd sel triemmen yn de globale della mutant. It eksperimint waard twa kear werhelle mei ferlykbere resultaten. ce ferliking fan de frekwinsje ferdieling fan sel divyzje plane oriïntaasjes yn de hiele SAM (d), IPR (e), en net-IPR (f) tusken Ler en globale della. P-wearden waarden krigen mei in twa-tailed Kolmogorov-Smirnov test. f, g 3D fisualisaasje fan konfokale bylden fan PI-bekleurde SAM fan Col-0 (i) en pCUC2 :: gai-1-VENUS (j) transgene planten. Panels (a, b) litte nije selwanden sjen (mar net primordia) foarme yn 'e SAM binnen 10 h. It eksperimint waard twa kear werhelle mei ferlykbere resultaten. h–j Ferliking fan de frekwinsje ferdieling fan sel divyzje fleanmasine oriïntaasjes leit yn de hiele SAM (h), IPR (i) en net-IPR (j) tusken Col-0 en pCUC2 :: gai-1-VENUS planten. P-wearden waarden krigen mei in twa-tailed Kolmogorov-Smirnov-test.
Wy testen folgjende it effekt fan it remmen fan GA-sinjalearring spesifyk yn 'e IPR. Dêrta brûkten wy de cotyledon cup 2 (CUC2) promotor om ekspresje te riden fan in dominant negatyf gai-1 proteïne fusearre oan VENUS (yn 'e pCUC2 :: gai-1-VENUS line). Yn 'e wylde-type SAM driuwt de CUC2-promotor útdrukking fan' e measte IPR's yn 'e SAM, ynklusyf grinssellen, fan P4 ôf, en ferlykbere spesifike ekspresje waard waarnommen yn pCUC2 :: gai-1-VENUS-planten (sjoch hjirûnder). De ferdieling fan seldielingshoeken oer de SAM of IPR fan pCUC2 :: gai-1-VENUS-planten wie net signifikant oars fan dy fan it wylde type, hoewol ûnferwachts fûnen wy dat sellen sûnder in IPR yn dizze planten ferdield op in hegere frekwinsje fan 80-90 ° (fig. 6f-j).
It is suggerearre dat de rjochting fan seldieling hinget ôf fan 'e mjitkunde fan' e SAM, benammen de trekspanning generearre troch de weefselkromme46. Wy fregen dêrom oft de foarm fan de SAM waard feroare yn de della globale mutant en pCUC2 :: gai-1-VENUS planten. Lykas earder rapportearre12, wie de grutte fan 'e della globale mutant SAM grutter as dy fan it wylde type (Supplementary Fig. 13a, b, d). In situ hybridisaasje fan CLV3 en STM RNA befêstige de meristem-útwreiding yn della-mutanten en toande fierder de laterale útwreiding fan 'e stamsel-niche (Supplementary Fig. 13e, f, h, i). De SAM-kromming wie lykwols ferlykber yn beide genotypen (Supplementary Fig. 13k, m, n, p). Wy observearre in ferlykbere ferheging fan grutte yn 'e gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della quadruple mutant sûnder in feroaring yn curvature yn ferliking mei it wylde type (oanfoljende Fig. 13c, d, g, j, l, o, p). De frekwinsje fan seldieling oriïntaasje waard ek beynfloede yn 'e della quadruple mutant, mar yn mindere mjitte as yn' e della monolithic mutant (Supplementary Fig. 12d-f). Dit dosering effekt, tegearre mei it ûntbrekken fan in effekt op curvature, suggerearret dat oerbleaune RGL3 aktiviteit yn de Della fjouwerfâldige mutant feroarings yn sel divyzje oriïntaasje beheint feroarsake troch ferlies fan DELLA aktiviteit en dat feroarings yn laterale sel divyzjes foarkomme yn reaksje op feroarings yn GA sinjalearjen aktiviteit ynstee feroarings yn SAM mjitkunde. Lykas hjirboppe beskreaun, driuwt de CUC2-promotor IPR-ekspresje yn 'e SAM begjinnend by P4 (Supplementary Fig. 14a, b), en yn tsjinstelling, de pCUC2 :: gai-1-VENUS SAM hie in fermindere grutte, mar hegere kromming (Supplementary Fig. 14c-h). Dizze feroaring yn pCUC2 :: gai-1-VENUS SAM morfology kin resultearje yn in oare ferdieling fan meganyske spanningen yn ferliking mei it wylde type, wêrby't hege circumferential spanningen begjinne op in koartere ôfstân fan it SAM sintrum47. As alternatyf kinne de wizigingen yn pCUC2 :: gai-1-VENUS SAM-morfology resultearje út feroaringen yn regionale meganyske eigenskippen dy't feroarsake binne troch transgene ekspresje48. Yn beide gefallen koe dit de effekten fan feroaringen yn GA-sinjalearring foar in part kompensearje troch de kâns te ferheegjen dat sellen sille ferdiele yn 'e omtrek / transversale oriïntaasje, en ús observaasjes ferklearje.
Mei-inoar befestigje ús gegevens dat hegere GA-sinjalearring in aktive rol spilet yn 'e laterale oriïntaasje fan it seldielingsfleantúch yn' e IPR. Se litte ek sjen dat meristem-kromme ek beynfloedet de oriïntaasje fan it seldielingsfleantúch yn 'e IPR.
De transversale oriïntaasje fan it divyzjefleantúch yn 'e IPR, troch hege GA-sinjalearjende aktiviteit, suggerearret dat GA in radiale selbestân yn' e epidermis binnen de SAM pre-organisearret om de sellulêre organisaasje te definiearjen dy't letter fûn wurde sil yn 'e epidermale internode. Ja, sokke selbestannen wiene faak sichtber yn SAM-ôfbyldings fan della globale mutanten (fig. 6b). Sa, om de ûntwikkelingsfunksje fan it romtlike patroan fan GA-sinjalearring yn 'e SAM fierder te ûndersykjen, brûkten wy time-lapse-ôfbylding om de romtlike organisaasje fan sellen yn' e IPR te analysearjen yn wyldtype (Ler en Col-0), della globale mutanten, en pCUC2 :: gai-1-VENUS transgene planten.
Wy fûnen dat qmRGA sjen liet dat GA-sinjalearjende aktiviteit yn 'e IPR ferhege fan P1 / P2 en peakde op P4, en dit patroan bleau konstant oer de tiid (Fig. 4a-f en Supplementary Fig. 8c-f, k). Om de romtlike organisaasje fan sellen yn 'e IPR te analysearjen mei tanimmend GA-sinjaal, markearren wy Ler IPR-sellen boppe en oan' e kanten fan P4 neffens har ûntwikkelingslot analysearre 34 h nei earste observaasje, dat wol sizze, mear as twa plastide kearen, wêrtroch't wy IPR-sellen kinne folgje tidens primordiumûntwikkeling fan P1 / P2 nei P4. Wy brûkten trije ferskillende kleuren: giel foar dy sellen dy't yntegrearre waarden yn 'e primordium tichtby P4, grien foar dyjingen dy't yn' e IPR wiene, en pears foar dyjingen dy't dielnimme oan beide prosessen (fig. 7a-c). By t0 (0 h) wiene 1-2 lagen fan IPR-sellen sichtber foar P4 (fig. 7a). As ferwachte, doe't dizze sellen ferdielden, diene se dat benammen fia it dwersferdielingsflak (figueren 7a–c). Fergelykbere resultaten waarden krigen mei help fan Col-0 SAM (rjochte op P3, waans grins falt fergelykber mei P4 yn Ler), hoewol yn dizze genotyp de fold foarme by de florale grins de IPR-sellen flugger ferburgen (Fig. 7g-i). Sa organisearret it divyzjepatroan fan IPR-sellen de sellen foarôf yn radiale rigen, lykas yn ynternoden. De organisaasje fan radiale rigen en de lokalisaasje fan IPR-sellen tusken opienfolgjende organen suggerearje dat dizze sellen ynternodale progenitors binne.
Hjir hawwe wy in ratiometryske GA-sinjalearjende biosensor, qmRGA, ûntwikkele dy't kwantitative mapping fan GA-sinjaalaktiviteit mooglik makket as gefolch fan kombineare GA- en GA-receptorkonsintraasjes, wylst ynterferinsje mei endogene sinjaalpaden minimearje, en dêrmei ynformaasje oer GA-funksje op sellulêr nivo. Dêrta konstruearren wy in wizige DELLA-proteïne, mRGA, dy't it fermogen ferlern hat om DELLA-ynteraksjepartners te binen, mar bliuwt gefoelich foar GA-induzearre proteolyse. qmRGA reagearret op sawol eksogene as endogene feroarings yn GA-nivo's, en syn dynamyske sensing-eigenskippen meitsje beoardieling fan spatiotemporale feroaringen yn GA-sinjalearjenaktiviteit mooglik by ûntwikkeling. qmRGA is ek in heul fleksibel ark, om't it kin wurde oanpast oan ferskate weefsels troch de promotor te feroarjen dy't brûkt wurdt foar har ekspresje (as nedich), en sjoen de bewarre aard fan 'e GA-sinjaalpaad en it PFYRE-motyf oer angiosperms, is it wierskynlik oerdraachber nei oare soarten22. Yn oerienstimming mei dit waard in lykweardige mutaasje yn it rys SLR1 DELLA-proteïne (HYY497AAA) ek oantoand om de groei-repressoraktiviteit fan SLR1 te ûnderdrukken, wylst mar in bytsje syn GA-bemiddele degradaasje fermindere, fergelykber mei mRGA23. Opmerklik lieten resinte stúdzjes yn Arabidopsis sjen dat in inkele aminosoermutaasje yn it PFYRE-domein (S474L) de transkripsjeaktiviteit fan RGA feroare sûnder har fermogen om te ynteraksje mei transkripsjefaktorpartners50 te beynfloedzjen. Hoewol dizze mutaasje heul ticht by de 3 aminosoerenferfangings oanwêzich is yn mRGA, litte ús stúdzjes sjen dat dizze twa mutaasjes ûnderskate skaaimerken fan DELLA feroarje. Hoewol de measte transkripsjefaktorpartners bine oan de LHR1- en SAW-domeinen fan DELLA26,51, kinne guon bewarre aminosoeren yn it PFYRE-domein helpe om dizze ynteraksjes te stabilisearjen.
Internode-ûntwikkeling is in wichtige eigenskip yn plantarsjitektuer en ferbettering fan opbringst. qmRGA iepenbiere hegere GA-sinjalearjende aktiviteit yn IPR-internode-progenitor-sellen. Troch it kombinearjen fan kwantitative imaging en genetika lieten wy sjen dat GA-sinjalearpatroanen sirkulêre / transversale seldielingsfleanen yn 'e SAM-epidermis oerlizze, en foarmje de seldielingsorganisaasje dy't nedich is foar ynternoadeûntwikkeling. Ferskate tafersjochhâlders fan seldieling fleantúch oriïntaasje binne identifisearre tidens ûntwikkeling52,53. Us wurk jout in dúdlik foarbyld fan hoe't GA-sinjaalaktiviteit dizze sellulêre parameter regelet. DELLA kin ynteraksje mei prefolding proteïnekompleksen41, sadat GA-sinjalearring de oriïntaasje fan it seldielingsfleantúch regelje kin troch direkte beynfloedzjen fan kortikale mikrotubule-oriïntaasje40,41,54,55. Wy lieten ûnferwachts sjen dat yn SAM it korrelaat fan hegere GA-sinjalearjende aktiviteit gjin selferlinging of divyzje wie, mar allinich groeianisotropy, dy't oerienkomt mei in direkte effekt fan GA op 'e rjochting fan seldieling yn' e IPR. Wy kinne lykwols net útslute dat dit effekt ek yndirekt kin wêze, bygelyks bemiddele troch GA-induzearre selmuorferwidering56. Feroaringen yn sellenmuorre eigenskippen induce meganyske stress57,58, dy't ek kin beynfloedzje de oriïntaasje fan de sel divyzje fleantúch troch it beynfloedzjen fan de oriïntaasje fan kortikale mikrotubules39,46,59. De kombineare effekten fan GA-induzearre meganyske stress en direkte regeling fan mikrotubule-oriïntaasje troch GA kinne belutsen wurde by it generearjen fan in spesifyk patroan fan seldieling-oriïntaasje yn 'e IPR om ynternoden te definiearjen, en fierdere stúdzjes binne nedich om dit idee te testen. Likemin hawwe eardere ûndersiken it belang fan 'e DELLA-ynteraktive proteïnen TCP14 en 15 yn' e kontrôle fan ynternodfoarming60,61 markearre en dizze faktoaren kinne de aksje fan GA bemiddelje tegearre mei BREVIPEDICELLUS (BP) en PENNYWISE (PNY), dy't de ûntwikkeling fan ynternode regelje en binne sjen litten te beynfloedzjen,62 GA-sinjalearring2. Sjoen dat DELLA's ynteraksje mei brassinosteroid, ethylene, jasmonyske sûr, en abscisic acid (ABA) sinjaalpaden63,64 en dat dizze hormonen mikrotubule-oriïntaasje kinne beynfloedzje65, kinne de effekten fan GA op seldielingsoriïntaasje ek wurde bemiddele troch oare hormonen.
Iere cytologyske stúdzjes lieten sjen dat sawol de binnen- as bûtenregio's fan 'e Arabidopsis SAM nedich binne foar ynternoadeûntwikkeling2,42. It feit dat GA aktyf de seldieling regelet yn 'e ynderlike weefsels12 stipet in dûbele funksje fan GA by it regulearjen fan meristem en internodegrutte yn' e SAM. It patroan fan rjochtingsseldieling wurdt ek strak regele yn it binnenste SAM-weefsel, en dizze regeling is essensjeel foar stamgroei52. It sil nijsgjirrich wêze om te ûndersiikjen oft GA ek in rol spilet by it oriïntearjen fan it seldielingsfleantúch yn 'e ynderlike SAM-organisaasje, en syngronisearje dêrmei de spesifikaasje en ûntwikkeling fan ynternoden binnen de SAM.
Planten waarden groeid yn vitro yn grûn of 1x Murashige-Skoog (MS) medium (Duchefa) oanfolle mei 1% sukrose en 1% agar (Sigma) ûnder standert betingsten (16 h ljocht, 22 ° C), útsein foar hypocotyl en woartel groei eksperiminten wêryn seedlings waarden groeid op fertikale platen ûnder konstant ljocht en 22 ° C. Foar nitraateksperiminten waarden planten groeid op modifisearre MS-medium (bioWORLD-plantmedium) oanfolle mei adekwate nitraat (0 of 10 mM KNO3), 0,5 mM NH4-succinate, 1% sukrose en 1% A-agar (Sigma) ûnder lange-dei omstannichheden.
GID1a cDNA ynfoege yn pDONR221 waard rekombinearre mei pDONR P4-P1R-pUBQ10 en pDONR P2R-P3-mCherry yn pB7m34GW om pUBQ10 :: GID1a-mCherry te generearjen. IDD2 DNA ynfoege yn pDONR221 waard rekombinearre yn pB7RWG266 om p35S:IDD2-RFP te generearjen. Om pGID1b :: 2xmTQ2-GID1b te generearjen, waarden in 3.9 kb-fragmint streamôfwerts fan 'e GID1b-kodearjende regio en in 4.7 kb-fragmint dat it GID1b-cDNA (1.3 kb) en terminator (3.4 kb) befette, earst fersterke mei de primers yn Oanfoljende Tabel 43 en dan yn PRPrmo Fisher Scientific) en pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), respektivelik, en úteinlik rekombinearre mei pDONR221 2xmTQ268 yn 'e pGreen 012567 doelfektor mei Gateway-kloning. Om pCUC2 :: LSSmOrange te generearjen, waard de CUC2-promotersekwinsje (3229 bp streamopôf fan ATG) folge troch de kodearringsequence fan grutte Stokes-ferskowe mOrange (LSSmOrange) 69 mei it N7-nukleêre lokalisaasjesinjaal en de NOS-transkripsjonele terminator gearstald yn it pGreen-fragmintfektorsysteem mei pGreen-fragminten kanamybin (Invitrogen). De plant binary vector waard yntrodusearre yn Agrobacterium tumefaciens stam GV3101 en yntrodusearre yn Nicotiana benthamiana blêden troch Agrobacterium ynfiltraasje metoade en yn Arabidopsis thaliana Col-0 troch floral dip metoade, respektivelik. pUBQ10 :: qmRGA pUBQ10 :: GID1a-mCherry en pCLV3 :: mCherry-NLS qmRGA waarden isolearre fan respektivelik de F3 en F1 neiteam fan de respektivelike krusingen.
RNA in situ hybridisaasje waard útfierd op likernôch 1 sm lange shoot tips72, dy't waarden sammele en fuortendaliks fêstmakke yn FAA oplossing (3.7% formaldehyde, 5% acetic acid, 50% ethanol) foargekoeld oant 4 ° C. Nei 2 × 15 min fakuümbehannelingen waard it fixatyf feroare en samples waarden oernachtich ynkubeare. GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2, en RGL3 cDNAs en antisense probes oan harren 3'-UTRs waarden synthesized mei help fan de primers werjûn yn oanfoljende Tabel 3 lykas beskreaun troch Rosier et al.73. Digoxigenin-labelde probes waarden ymmunodetektearre mei digoxigenine-antylders (3000-fâldige ferwidering; Roche, katalogusnûmer: 11 093 274 910), en seksjes waarden kleurd mei 5-bromo-4-chloro-3-indolylfosfaat (BCIP, 250-fold diluet (N) 200-fâldige verdunning) oplossing.
Post tiid: Febrewaris 10-2025