De groei fan it apikale meristeem (SAM) fan 'e scheuten is krúsjaal foar de stamarsjitektuer. Planthormonengibberellinen(GA's) spylje wichtige rollen yn it koördinearjen fan plantgroei, mar har rol yn 'e SAM bliuwt min begrepen. Hjir hawwe wy in ratiometryske biosensor fan GA-sinjalearring ûntwikkele troch it DELLA-proteïne te manipulearjen om syn essensjele regeljouwingsfunksje yn 'e GA-transkripsjonele respons te ûnderdrukken, wylst syn degradaasje by GA-erkenning bewarre bliuwt. Wy litte sjen dat dizze degradaasje-basearre biosensor feroarings yn GA-nivo's en sellulêre deteksje tidens ûntwikkeling sekuer registrearret. Wy hawwe dizze biosensor brûkt om GA-sinjalearringsaktiviteit yn 'e SAM yn kaart te bringen. Wy litte sjen dat hege GA-sinjalen foaral oanwêzich binne yn sellen dy't lizze tusken oargelprimordia, dy't foargongers binne fan ynternodiumsellen. Mei help fan gain- en loss-of-function-oanpakken litte wy fierder sjen dat GA de oriïntaasje fan it seldielingsflak regelet, wêrtroch't de kanonike sellulêre organisaasje fan ynternodiums fêststeld wurdt, en dêrmei de ynternodiumspesifikaasje yn 'e SAM befoarderet.
It spruittopmeristeem (SAM), lizzend oan 'e spruittop, befettet in nis fan stamsellen waans aktiviteit laterale organen en stamknooppunten genereart op in modulêre en iterative manier yn it libben fan 'e plant. Elk fan dizze werhellende ienheden, of plantknooppunten, omfettet ynternodiën en laterale organen by de knooppunten, en okselmeristemen yn 'e blêdoksels1. De groei en organisaasje fan plantknooppunten feroaret tidens ûntwikkeling. Yn Arabidopsis wurdt ynternodiale groei ûnderdrukt tidens it fegetative stadium, en okselmeristemen bliuwe sliepend yn 'e oksels fan rosetblêden. Tidens de oergong nei de blomfaze wurdt de SAM it bloeiwizemeristeem, wêrtroch langwerpige ynternodiën en okselknoppen, tûken yn 'e oksels fan steakblêden, en letter, blêdleaze blommen2 generearre wurde. Hoewol wy wichtige foarútgong hawwe makke yn it begripen fan 'e meganismen dy't de inisjaasje fan blêden, blommen en tûken kontrolearje, is relatyf min bekend oer hoe't ynternodiën ûntsteane.
It begripen fan 'e spatiotemporele ferdieling fan GA's sil helpe om de funksjes fan dizze hormonen yn ferskate weefsels en yn ferskate ûntwikkelingsstadia better te begripen. Fisualisaasje fan 'e degradaasje fan RGA-GFP-fúzje útdrukt ûnder de aksje fan syn eigen promotor jout wichtige ynformaasje oer de regeling fan totale GA-nivo's yn woartels15,16. RGA-ekspresje ferskilt lykwols oer weefsels17 en wurdt regele troch GA18. Sa kin ferskillende ekspresje fan 'e RGA-promotor resultearje yn it fluoreszinsjepatroan dat waarnommen wurdt mei RGA-GFP en dus is dizze metoade net kwantitatyf. Mear resint hat bioaktive fluoresceïne (Fl)-labelde GA19,20 de opgarjen fan GA yn 'e woartelendokortex en de regeling fan syn sellulêre nivo's troch GA-transport oantoand. Koartlyn hat de GA FRET-sensor nlsGPS1 oantoand dat GA-nivo's korrelearje mei selferlinging yn woartels, filamenten en tsjustergroeide hypokotylen21. Lykas wy lykwols sjoen hawwe, is GA-konsintraasje net de ienige parameter dy't GA-sinjaalaktiviteit kontrolearret, om't it ôfhinklik is fan komplekse deteksjeprosessen. Hjir, bouwend op ús begryp fan 'e DELLA- en GA-sinjaalpaden, rapportearje wy de ûntwikkeling en karakterisaasje fan in degradaasje-basearre ratiometryske biosensor foar GA-sinjalearring. Om dizze kwantitative biosensor te ûntwikkeljen, brûkten wy in mutante GA-gefoelige RGA dy't fusearre wie mei in fluorescerend proteïne en oeral útdrukt waard yn weefsels, lykas in GA-ûngefoelich fluorescerend proteïne. Wy litte sjen dat de mutante RGA-proteïnefúzjes gjin ynterferinsje hawwe mei endogene GA-sinjalearring as se oeral útdrukt wurde, en dat dizze biosensor sinjalearringsaktiviteit kin kwantifisearje dy't ûntstiet út sawol GA-ynfier as GA-sinjaalferwurking troch it sensorapparaat mei hege spatiotemporele resolúsje. Wy brûkten dizze biosensor om de spatiotemporele ferdieling fan GA-sinjalearringsaktiviteit yn kaart te bringen en te kwantifisearjen hoe't GA sellulêr gedrach yn 'e SAM-epidermis regelet. Wy demonstrearje dat GA de oriïntaasje fan it dielingsflak fan SAM-sellen regelet dy't tusken oargelprimordia lizze, en dêrmei de kanonike sellulêre organisaasje fan 'e internode definiearret.
Uteinlik hawwe wy frege oft qmRGA feroarings yn endogene GA-nivo's melde koe mei groeiende hypokotylen. Wy hawwe earder oantoand dat nitraat groei stimulearret troch GA-synteze te ferheegjen en, op syn beurt, DELLA34-ôfbraak. Dêrom hawwe wy waarnommen dat de hypokotyllingte yn pUBQ10::qmRGA-siedlingen dy't groeid binne ûnder in oerfloedige nitraatfoarsjenning (10 mM NO3−) signifikant langer wie as dy yn siedlingen dy't groeid binne ûnder nitraat-tekoarte omstannichheden (Oanfoljende Fig. 6a). Yn oerienstimming mei de groeireaksje wiene GA-sinjalen heger yn hypokotylen fan siedlingen dy't groeid binne ûnder 10 mM NO3−-omstannichheden as yn siedlingen dy't groeid binne sûnder nitraat (Oanfoljende Fig. 6b, c). Sa makket qmRGA ek it mooglik om feroarings yn GA-sinjalearring te kontrolearjen dy't feroarsake wurde troch endogene feroarings yn GA-konsintraasje.
Om te begripen oft de GA-sinjaalaktiviteit dy't detektearre wurdt troch qmRGA ôfhinklik is fan GA-konsintraasje en GA-persepsje, lykas ferwachte op basis fan it sensorûntwerp, hawwe wy de ekspresje fan 'e trije GID1-receptors yn fegetative en reproduktive weefsels analysearre. Yn siedlings liet de GID1-GUS-reporterline sjen dat GID1a en c heech útdrukt waarden yn kiemblêden (Fig. 3a-c). Derneist waarden alle trije receptors útdrukt yn blêden, laterale woartelprimordia, woartelpunten (útsein de woartelkap fan GID1b), en it fasskulêre systeem (Fig. 3a-c). Yn 'e bloeiwize SAM hawwe wy allinich GUS-sinjalen detektearre foar GID1b en 1c (Oanfoljende Fig. 7a-c). In situ hybridisaasje befêstige dizze ekspresjepatroanen en demonstrearre fierder dat GID1c unifoarm útdrukt waard op lege nivo's yn 'e SAM, wylst GID1b hegere ekspresje liet sjen oan 'e periferie fan' e SAM (Oanfoljende Fig. 7d-l). De pGID1b::2xmTQ2-GID1b translasjonele fúzje liet ek in gradearre berik fan GID1b-ekspresje sjen, fan lege of gjin ekspresje yn it sintrum fan 'e SAM oant hege ekspresje oan 'e orgaangrinzen (Oanfoljende Fig. 7m). Sa binne GID1-receptors net unifoarm ferdield oer en binnen weefsels. Yn folgjende eksperiminten hawwe wy ek waarnommen dat oerekspresje fan GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) de gefoelichheid fan qmRGA yn hypokotylen foar eksterne GA-tapassing fergrutte (Fig. 3d, e). Yn tsjinstelling wie fluoreszinsje metten troch qd17mRGA yn 'e hypokotyl net gefoelich foar GA3-behanneling (Fig. 3f, g). Foar beide assays waarden siedlings behannele mei hege konsintraasjes fan GA (100 μM GA3) om it rappe gedrach fan 'e sensor te beoardieljen, wêrby't it fermogen om te binen oan 'e GID1-receptor ferbettere of ferlern wie. Tegearre befêstigje dizze resultaten dat de qmRGA-biosensor in kombineare funksje tsjinnet as in GA- en GA-sensor, en suggerearje dat ferskillende ekspresje fan 'e GID1-reseptor de emissiviteit fan' e sensor signifikant modulearje kin.
Oant no ta is de ferdieling fan GA-sinjalen yn 'e SAM ûndúdlik. Dêrom hawwe wy qmRGA-ekspressearjende planten en de pCLV3::mCherry-NLS stamselreporter35 brûkt om kwantitative kaarten mei hege resolúsje fan GA-sinjaalaktiviteit te berekkenjen, mei fokus op 'e L1-laach (epidermis; Fig. 4a, b, sjoch Metoaden en Oanfoljende Metoaden), om't L1 in wichtige rol spilet by it kontrolearjen fan SAM-groei36. Hjir levere pCLV3::mCherry-NLS-ekspresje in fêst geometrysk referinsjepunt foar it analysearjen fan 'e spatiotemporele ferdieling fan GA-sinjaalaktiviteit37. Hoewol GA as essensjeel beskôge wurdt foar laterale oargelûntwikkeling4, hawwe wy waarnommen dat GA-sinjalen leech wiene yn it florale primordium (P) begjinnend fan it P3-stadium (Fig. 4a, b), wylst jonge P1- en P2-primordiums matige aktiviteit hiene fergelykber mei dy yn 'e sintrale regio (Fig. 4a, b). Hegere GA-sinjaalaktiviteit waard ûntdutsen by de grinzen fan it oargelprimordium, begjinnend by P1/P2 (oan 'e kanten fan' e grins) en mei in pyk by P4, lykas yn alle sellen fan 'e perifeare regio tusken de primordia (Ofb. 4a, b en Oanfoljende Ofb. 8a, b). Dizze hegere GA-sinjaalaktiviteit waard net allinich waarnommen yn 'e epidermis, mar ek yn' e L2- en boppeste L3-lagen (Oanfoljende Ofb. 8b). It patroan fan GA-sinjalen dat waard ûntdutsen yn 'e SAM mei qmRGA bleau ek net feroare yn' e rin fan 'e tiid (Oanfoljende Ofb. 8c–f, k). Hoewol it qd17mRGA-konstrukt systematysk delregulearre waard yn 'e SAM fan T3-planten fan fiif ûnôfhinklike linen dy't wy yn detail karakterisearre hawwe, koene wy de fluoreszinsjepatroanen analysearje dy't krigen waarden mei it pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP-konstrukt (Oanfoljende Ofb. 8g–j, l). Yn dizze kontrôleline waarden allinich lytse feroaringen yn 'e fluoreszinsjeferhâlding ûntdutsen yn' e SAM, mar yn it SAM-sintrum seagen wy in dúdlike en ûnferwachte ôfname yn VENUS assosjeare mei TagBFP. Dit befêstiget dat it sinjaalpatroan dat waarnommen wurdt troch qmRGA de GA-ôfhinklike degradaasje fan mRGA-VENUS reflektearret, mar ek demonstrearret dat qmRGA de GA-sinjaalaktiviteit yn it meristeemsintrum miskien oerskatte kin. Gearfetsjend litte ús resultaten in GA-sinjaalpatroan sjen dat primêr de ferdieling fan primordia reflektearret. Dizze ferdieling fan 'e ynter-primordiale regio (IPR) is te tankjen oan 'e stadige oprjochting fan hege GA-sinjaalaktiviteit tusken it ûntwikkeljende primordium en de sintrale regio, wylst tagelyk de GA-sinjaalaktiviteit yn it primordium ôfnimt (Fig. 4c, d).
De ferdieling fan GID1b- en GID1c-receptors (sjoch hjirboppe) suggerearret dat ferskillende ekspresje fan GA-receptors helpt by it foarmjaan fan it patroan fan GA-sinjaalaktiviteit yn 'e SAM. Wy fregen ús ôf oft ferskillende opgarjen fan GA dermei belutsen wêze kin. Om dizze mooglikheid te ûndersykjen, brûkten wy de nlsGPS1 GA FRET-sensor21. Ferhege aktivearringsfrekwinsje waard ûntdutsen yn 'e SAM fan nlsGPS1 behannele mei 10 μM GA4+7 foar 100 minuten (Oanfoljende Fig. 9a-e), wat oanjout dat nlsGPS1 reagearret op feroaringen yn GA-konsintraasje yn 'e SAM, lykas it docht yn woartels21. Romtlike ferdieling fan nlsGPS1-aktivearringsfrekwinsje liet relatyf lege GA-nivo's sjen yn 'e bûtenste lagen fan 'e SAM, mar liet sjen dat se ferhege wiene yn it sintrum en oan 'e rânen fan 'e SAM (Fig. 4e en Oanfoljende Fig. 9a,c). Dit suggerearret dat GA ek ferspraat is yn 'e SAM mei in romtlik patroan te fergelykjen mei dat bliken docht út qmRGA. As in komplementêre oanpak hawwe wy de SAM ek behannele mei fluoreszint GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) of allinich Fl as in negative kontrôle. It Fl-sinjaal waard ferspraat oer de SAM, ynklusyf de sintrale regio en it primordium, hoewol mei in legere yntensiteit (Fig. 4j en Oanfoljende Fig. 10d). Yn tsjinstelling, alle trije GA-Fl sammelen har spesifyk op binnen de grinzen fan 'e primordium en yn ferskillende mjitte yn 'e rest fan 'e IPR, wêrby't GA7-Fl him opstapelde yn it grutste domein yn 'e IPR (Fig. 4k en Oanfoljende Fig. 10a,b). Kwantifikaasje fan fluoreszinsje-yntensiteit liet sjen dat de ferhâlding tusken IPR en net-IPR-yntensiteit heger wie yn GA-Fl-behannele SAM yn ferliking mei Fl-behannele SAM (Fig. 4l en Oanfoljende Fig. 10c). Tegearre suggerearje dizze resultaten dat GA oanwêzich is yn hegere konsintraasjes yn IPR-sellen dy't it tichtst by de oargelgrins lizze. Dit suggerearret dat it patroan fan SAM GA-sinjalearringsaktiviteit it gefolch is fan sawol ferskillende ekspresje fan GA-receptors as ferskillende opgarjen fan GA yn IPR-sellen tichtby oargelgrinzen. Sa die bliken út ús analyze in ûnferwachte spatiotemporele patroan fan GA-sinjalearring, mei legere aktiviteit yn it sintrum en primordium fan 'e SAM en hegere aktiviteit yn 'e IPR yn 'e perifeare regio.
Om de rol fan differinsjele GA-sinjaalaktiviteit yn 'e SAM te begripen, hawwe wy de korrelaasje tusken GA-sinjaalaktiviteit, selútwreiding en seldieling analysearre mei real-time time-lapse-ôfbylding fan 'e SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. Mei it each op 'e rol fan GA yn groeiregeling waard in positive korrelaasje mei selútwreidingsparameters ferwachte. Dêrom hawwe wy earst GA-sinjaalaktiviteitskaarten fergelike mei kaarten fan seloerflakgroeisnelheid (as in proxy foar de sterkte fan selútwreiding foar in bepaalde sel en foar dochtersellen by dieling) en mei kaarten fan groeianisotropie, dy't de rjochting fan selútwreiding mjit (ek hjir brûkt foar in bepaalde sel en foar dochtersellen by dieling; Fig. 5a,b, sjoch Metoaden en Oanfoljende Metoaden). Us kaarten fan SAM-seloerflakgroeisnelheid binne yn oerienstimming mei eardere observaasjes38,39, mei minimale groeisnelheden oan 'e grins en maksimale groeisnelheden yn ûntwikkeljende blommen (Fig. 5a). Haadkomponintanalyse (PCA) liet sjen dat GA-sinjaalaktiviteit negatyf korrelearre wie mei seloerflakgroeiintensiteit (Figuer 5c). Wy hawwe ek oantoand dat de wichtichste assen fan fariaasje, ynklusyf GA-sinjalearringsynfier en groeiintensiteit, ortogonaal wiene oan 'e rjochting bepaald troch hege CLV3-ekspresje, wat de útsluting fan sellen út it SAM-sintrum yn 'e oerbleaune analyses befêstige. Spearman-korrelaasjeanalyse befêstige de PCA-resultaten (figuer 5d), wat oanjout dat hegere GA-sinjalen yn 'e IPR net resultearren yn hegere selútwreiding. Korrelaasjeanalyse liet lykwols in lichte positive korrelaasje sjen tusken GA-sinjalearringsaktiviteit en groeianisotropie (figuer 5c, d), wat suggerearret dat hegere GA-sinjalearring yn 'e IPR de rjochting fan selgroei en mooglik de posysje fan it seldielingsflak beynfloedet.
a, b Waarmtekaarten fan gemiddelde oerflakgroei (a) en groeianisotropie (b) yn SAM gemiddeld oer sân ûnôfhinklike planten (brûkt as proxy's foar respektivelik de sterkte en rjochting fan selútwreiding). c PCA-analyze omfette de folgjende fariabelen: GA-sinjaal, oerflakgroeiintensiteit, oerflakgroeianisotropie en CLV3-ekspresje. PCA-komponint 1 wie benammen negatyf korrelearre mei oerflakgroeiintensiteit en posityf korrelearre mei GA-sinjaal. PCA-komponint 2 wie benammen posityf korrelearre mei oerflakgroeianisotropie en negatyf korrelearre mei CLV3-ekspresje. Persintaazjes fertsjintwurdigje de fariaasje dy't troch elke komponint ferklearre wurdt. d Spearman-korrelaasjeanalyze tusken GA-sinjaal, oerflakgroeiintensiteit en oerflakgroeianisotropie op weefselskaal sûnder CZ. It getal oan 'e rjochterkant is de Spearman rho-wearde tusken twa fariabelen. Asterisken jouwe gefallen oan wêr't de korrelaasje/negative korrelaasje tige signifikant is. e 3D-visualisaasje fan Col-0 SAM L1-sellen troch konfokale mikroskopie. Nije selwanden foarme yn 'e SAM (mar net it primordium) nei 10 oeren binne kleurd neffens har hoekewearden. De kleurbalke wurdt werjûn yn 'e rjochter ûnderhoeke. De ynfoegsel lit de oerienkommende 3D-ôfbylding sjen op 0 oeren. It eksperimint waard twa kear werhelle mei ferlykbere resultaten. f Fakplots litte selsdielingssnelheden sjen yn IPR- en net-IPR Col-0 SAM (n = 10 ûnôfhinklike planten). De sintrumline lit de mediaan sjen, en de fakgrinzen jouwe de 25e en 75e persintilen oan. Whiskers jouwe de minimale en maksimale wearden oan dy't bepaald binne mei R-software. P-wearden waarden krigen mei Welch's twasidige t-test. g, h Skematysk diagram dat (g) sjen lit hoe't de hoeke fan 'e nije selwand (magenta) mjitten wurde kin mei respekt foar de radiale rjochting fan it sintrum fan 'e SAM (wite stippele line) (allinich skerpe hoekewearden, d.w.s. 0–90°, wurde beskôge), en (h) de omtreks-/laterale en radiale rjochtingen binnen it meristeem. i Frekwinsjehistogrammen fan selsdielingsflakoriïntaasje oer de SAM (donkerblau), IPR (middelblau), en net-IPR (ljochtblau), respektivelik. P-wearden waarden krigen troch in twasidige Kolmogorov-Smirnov-test. It eksperimint waard twa kear werhelle mei ferlykbere resultaten. j Frekwinsjehistogrammen fan 'e oriïntaasje fan it seldielingsflak fan 'e IPR om P3 (ljochtgrien), P4 (middelgrien) en P5 (donkergrien), respektivelik. P-wearden waarden krigen troch in twasidige Kolmogorov-Smirnov-test. It eksperimint waard twa kear werhelle mei ferlykbere resultaten.
Dêrom hawwe wy dêrnei de korrelaasje tusken GA-sinjalearring en seldielingsaktiviteit ûndersocht troch nij foarme selwanden te identifisearjen tidens de assay (Fig. 5e). Dizze oanpak stelde ús yn steat om de frekwinsje en rjochting fan seldieling te mjitten. Ferrassenderwize fûnen wy dat de frekwinsje fan seldielingen yn 'e IPR en de rest fan 'e SAM (net-IPR, Fig. 5f) fergelykber wie, wat oanjout dat ferskillen yn GA-sinjalearring tusken IPR- en net-IPR-sellen gjin signifikante ynfloed hawwe op seldieling. Dit, en de positive korrelaasje tusken GA-sinjalearring en groeianisotropie, hawwe ús derta oanset om te beskôgjen oft GA-sinjalearringsaktiviteit de oriïntaasje fan it seldielingsflak beynfloedzje koe. Wy hawwe de oriïntaasje fan 'e nije selwand metten as in skerpe hoeke relatyf oan 'e radiale as dy't it meristeemsintrum en it sintrum fan 'e nije selwand ferbynt (Fig. 5e-i) en in dúdlike oanstriid waarnommen foar sellen om te dielen ûnder hoeken tichtby 90° relatyf oan 'e radiale as, mei de heechste frekwinsjes waarnommen by 70–80° (23,28%) en 80–90° (22,62%) (Fig. 5e,i), oerienkommende mei seldielingen yn 'e sirkumferinsjele/transversale rjochting (Fig. 5h). Om de bydrage fan GA-sinjalearring oan dit seldielingsgedrach te ûndersykjen, hawwe wy seldielingsparameters yn 'e IPR en net-IPR apart analysearre (Fig. 5i). Wy seagen dat de ferdielingshoekeferdieling yn IPR-sellen ferskilde fan dy yn net-IPR-sellen of yn sellen yn 'e heule SAM, wêrby't IPR-sellen in heger oandiel fan laterale/sirkelfoarmige seldielingen sjen lieten, d.w.s. 70–80° en 80–90° (respektyflik 33,86% en 30,71%, oerienkommende proporsjes) (Fig. 5i). Sa lieten ús observaasjes in assosjaasje sjen tusken hege GA-sinjalearring en in oriïntaasje fan it seldielingsflak tichtby de omtrekrjochting, fergelykber mei de korrelaasje tusken GA-sinjalearringsaktiviteit en groeianisotropie (Fig. 5c, d). Om de romtlike behâld fan dizze assosjaasje fierder fêst te stellen, hawwe wy de oriïntaasje fan it seldielingsflak metten yn IPR-sellen om it primordium hinne begjinnend fan P3, om't de heechste GA-sinjalearringsaktiviteit waard waarnommen yn dizze regio begjinnend fan P4 (Fig. 4). De dielingshoeken fan 'e IPR om P3 en P4 lieten gjin statistysk signifikante ferskillen sjen, hoewol in ferhege frekwinsje fan laterale seldielingen waard waarnommen yn 'e IPR om P4 hinne (Fig. 5j). Yn 'e IPR-sellen om P5 hinne waard it ferskil yn 'e oriïntaasje fan it seldielingsflak lykwols statistysk signifikant, mei in skerpe tanimming fan 'e frekwinsje fan transversale seldielingen (Fig. 5j). Tegearre suggerearje dizze resultaten dat GA-sinjalearring de oriïntaasje fan seldielingen yn 'e SAM kin kontrolearje, wat oerienkomt mei eardere rapporten40,41 dat hege GA-sinjalearring laterale oriïntaasje fan seldielingen yn 'e IPR kin indusearje.
Der wurdt foarsein dat sellen yn 'e IPR net yn primordia opnommen wurde sille, mar leaver yn internodes2,42,43. De transversale oriïntaasje fan seldielingen yn 'e IPR kin resultearje yn 'e typyske organisaasje fan parallelle longitudinale rigen fan epidermale sellen yn internodes. Us hjirboppe beskreaune observaasjes suggerearje dat GA-sinjalearring wierskynlik in rol spilet yn dit proses troch de rjochting fan seldieling te regeljen.
Ferlies fan funksje fan ferskate DELLA-genen resulteart yn in konstitutive GA-reaksje, en della-mutanten kinne brûkt wurde om dizze hypoteze te testen44. Wy hawwe earst de ekspresjepatroanen fan fiif DELLA-genen yn 'e SAM analysearre. Transkripsjonele fúzje fan 'e GUS-line45 liet sjen dat GAI, RGA, RGL1 en RGL2 (yn in folle mindere mate) útdrukt waarden yn 'e SAM (Oanfoljende Fig. 11a-d). In situ-hybridisaasje liet fierder sjen dat GAI mRNA spesifyk ophoopt yn primordia en ûntwikkeljende blommen (Oanfoljende Fig. 11e). RGL1- en RGL3-mRNA waarden ûntdutsen yn 'e heule SAM-kroon en yn âldere blommen, wylst RGL2-mRNA mear oerfloedich wie yn it grinsgebiet (Oanfoljende Fig. 11f-h). Konfokale ôfbylding fan pRGL3::RGL3-GFP SAM befêstige de ekspresje waarnommen troch in situ-hybridisaasje en liet sjen dat RGL3-proteïne ophoopt yn it sintrale diel fan 'e SAM (Oanfoljende Fig. 11i). Mei help fan de pRGA::GFP-RGA-line hawwe wy ek fûn dat RGA-proteïne him ophoopt yn 'e SAM, mar syn oerfloed nimt ôf by de grins begjinnend fan P4 (Oanfoljende Fig. 11j). It is opmerklik dat de ekspresjepatroanen fan RGL3 en RGA oerienkomme mei hegere GA-sinjaalaktiviteit yn 'e IPR, lykas detektearre troch qmRGA (Fig. 4). Boppedat jouwe dizze gegevens oan dat alle DELLA's útdrukt wurde yn 'e SAM en dat har ekspresje kollektyf de heule SAM omfiemet.
Wy hawwe dêrnei de seldielingsparameters analysearre yn 'e wild-type SAM (Ler, kontrôle) en de gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (globale) mutanten (Fig. 6a, b). Nijsgjirrich is dat wy in statistysk signifikante ferskowing seagen yn 'e ferdieling fan seldielingshoekfrekwinsjes yn 'e della global mutant SAM yn ferliking mei it wild-type (Fig. 6c). Dizze feroaring yn 'e della global mutant wie te tankjen oan in tanimming fan 'e frekwinsje fan 80–90° hoeken (34,71% vs. 24,55%) en, yn mindere mate, 70–80° hoeken (23,78% vs. 20,18%), d.w.s., oerienkommende mei transversale seldielingen (Fig. 6c). De frekwinsje fan net-transversale dielingen (0–60°) wie ek leger yn 'e della global mutant (Fig. 6c). De frekwinsje fan transversale seldielingen wie signifikant ferhege yn 'e SAM fan 'e della global mutant (Fig. 6b). De frekwinsje fan transversale seldielingen yn 'e IPR wie ek heger yn 'e della global mutant yn ferliking mei it wylde type (Fig. 6d). Bûten de IPR-regio hie it wylde type in mear unifoarme ferdieling fan seldielingshoeken, wylst de della global mutant tangensiële dielingen foarkar joech lykas de IPR (Fig. 6e). Wy kwantifisearren ek de oriïntaasje fan seldielingen yn 'e SAM fan ga2 oxidase (ga2ox) fiifvoudige mutanten (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1, en ga2ox6-2), in GA-ynaktive mutantachtergrûn wêryn GA ophoopt. Yn oerienstimming mei de tanimming fan GA-nivo's wie de SAM fan 'e fiifvoudige ga2ox-mutantbloeistof grutter as dy fan Col-0 (Oanfoljende Fig. 12a, b), en yn ferliking mei Col-0 liet de fiifvoudige ga2ox SAM in dúdlik oare ferdieling fan seldielingshoeken sjen, wêrby't de hoekefrekwinsje tanommen fan 50° nei 90°, d.w.s. wer tangensiële dielingen befoarderje (Oanfoljende Fig. 12a-c). Sa litte wy sjen dat konstitutive aktivearring fan GA-sinjalearring en GA-akkumulaasje laterale seldielingen yn 'e IPR en de rest fan 'e SAM ynducearje.
a, b 3D-visualisaasje fan 'e L1-laach fan PI-kleurde Ler (a) en globale della-mutant (b) SAM mei konfokale mikroskopie. Nije selwanden dy't foarme binne yn 'e SAM (mar net it primordium) oer in perioade fan 10 oeren wurde werjûn en kleurd neffens har hoekewearden. De ynfoegsel lit de SAM sjen op 0 oeren. De kleurbalke wurdt werjûn yn 'e rjochter ûnderhoeke. De pylk yn (b) wiist nei in foarbyld fan ôfstimde selbestannen yn 'e globale della-mutant. It eksperimint waard twa kear werhelle mei ferlykbere resultaten. ce-ferliking fan 'e frekwinsjeferdieling fan seldielingsflakoriïntaasjes yn 'e heule SAM (d), IPR (e), en net-IPR (f) tusken Ler en globale della. P-wearden waarden krigen mei in twasidige Kolmogorov-Smirnov-test. f, g 3D-visualisaasje fan konfokale ôfbyldings fan PI-kleurde SAM fan Col-0 (i) en pCUC2::gai-1-VENUS (j) transgene planten. Panielen (a, b) litte nije selwanden (mar net primordia) sjen dy't binnen 10 oeren yn 'e SAM foarme binne. It eksperimint waard twa kear werhelle mei ferlykbere resultaten. h–j Ferliking fan 'e frekwinsjeferdieling fan seldielingsflakoriïntaasjes yn 'e heule SAM (h), IPR (i) en net-IPR (j) tusken Col-0- en pCUC2::gai-1-VENUS-planten. P-wearden waarden krigen mei in twasidige Kolmogorov-Smirnov-test.
Wy hawwe dêrnei it effekt fan it remmen fan GA-sinjalearring spesifyk yn 'e IPR testen. Hjirfoar hawwe wy de cotyledon cup 2 (CUC2) promotor brûkt om de ekspresje fan in dominant negatyf gai-1-protein fusearre mei VENUS (yn 'e pCUC2::gai-1-VENUS-line) oan te driuwen. Yn 'e wildtype SAM driuwt de CUC2-promotor de ekspresje fan 'e measte IPR's yn 'e SAM, ynklusyf grinszellen, fan P4 ôf, en ferlykbere spesifike ekspresje waard waarnommen yn pCUC2::gai-1-VENUS-planten (sjoch hjirûnder). De ferdieling fan seldielingshoeken oer de SAM of IPR fan pCUC2::gai-1-VENUS-planten wie net signifikant oars as dy fan it wildtype, hoewol wy ûnferwachts fûnen dat sellen sûnder in IPR yn dizze planten mei in hegere frekwinsje fan 80-90° dielden (Fig. 6f-j).
Der is suggerearre dat de rjochting fan seldieling ôfhinklik is fan 'e geometry fan 'e SAM, yn it bysûnder de trekspanning dy't generearre wurdt troch de kromming fan it weefsel46. Wy hawwe dêrom frege oft de foarm fan 'e SAM feroare wie yn 'e della global mutant en pCUC2::gai-1-VENUS planten. Lykas earder rapportearre12, wie de grutte fan 'e della global mutant SAM grutter as dy fan it wylde type (Oanfoljende Fig. 13a, b, d). In situ hybridisaasje fan CLV3 en STM RNA befêstige de meristeemútwreiding yn della mutanten en liet fierder de laterale útwreiding fan 'e stamselnis sjen (Oanfoljende Fig. 13e, f, h, i). De kromming fan 'e SAM wie lykwols fergelykber yn beide genotypen (Oanfoljende Fig. 13k, m, n, p). Wy seagen in ferlykbere tanimming fan grutte yn 'e gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della fjouwerfâldige mutant sûnder in feroaring yn kromming yn ferliking mei it wylde type (Oanfoljende Fig. 13c, d, g, j, l, o, p). De frekwinsje fan seldielingsoriïntaasje waard ek beynfloede yn 'e della quadruple mutant, mar yn mindere mate as yn 'e della monolityske mutant (Oanfoljende Fig. 12d-f). Dit dosaasje-effekt, tegearre mei it ûntbrekken fan in effekt op kromming, suggerearret dat oerbleaune RGL3-aktiviteit yn 'e Della quadruple mutant feroarings yn seldielingsoriïntaasje beheint feroarsake troch ferlies fan DELLA-aktiviteit en dat feroarings yn laterale seldielingen foarkomme as reaksje op feroarings yn GA-sinjaalaktiviteit ynstee fan feroarings yn SAM-geometry. Lykas hjirboppe beskreaun, driuwt de CUC2-promotor IPR-ekspresje yn 'e SAM begjinnend by P4 (Oanfoljende Fig. 14a, b), en yn tsjinstelling hie de pCUC2::gai-1-VENUS SAM in fermindere grutte mar hegere kromming (Oanfoljende Fig. 14c-h). Dizze feroaring yn pCUC2::gai-1-VENUS SAM-morfology kin resultearje yn in oare ferdieling fan meganyske stress yn ferliking mei it wylde type, wêryn hege sirkumferinsjele stress begjinne op in koartere ôfstân fan it SAM-sintrum47. As alternatyf kinne de feroarings yn 'e morfology fan pCUC2::gai-1-VENUS SAM it gefolch wêze fan feroarings yn regionale meganyske eigenskippen feroarsake troch transgenekspresje48. Yn beide gefallen koe dit de effekten fan feroarings yn GA-sinjalearring foar in part kompensearje troch de kâns te fergrutsjen dat sellen sille diele yn 'e sirkumferinsjele/transversale oriïntaasje, wat ús waarnimmings ferklearret.
Mei-inoar befêstigje ús gegevens dat hegere GA-sinjalearring in aktive rol spilet yn 'e laterale oriïntaasje fan it seldielingsflak yn 'e IPR. Se litte ek sjen dat meristeemkromming ek ynfloed hat op 'e oriïntaasje fan it seldielingsflak yn 'e IPR.
De transversale oriïntaasje fan it dielingsflak yn 'e IPR, fanwegen hege GA-sinjaalaktiviteit, suggerearret dat GA in radiaal selbestân yn 'e epidermis binnen de SAM foarôf organisearret om de sellulêre organisaasje te definiearjen dy't letter fûn wurde sil yn 'e epidermale internode. Yndied, sokke selbestannen wiene faak sichtber yn SAM-ôfbyldings fan della global mutanten (Fig. 6b). Om de ûntwikkelingsfunksje fan it romtlike patroan fan GA-sinjalearring yn 'e SAM fierder te ûndersiikjen, hawwe wy dus time-lapse-ôfbylding brûkt om de romtlike organisaasje fan sellen yn 'e IPR te analysearjen yn wildtype (Ler en Col-0), della global mutanten, en pCUC2::gai-1-VENUS transgene planten.
Wy fûnen dat qmRGA oantoande dat GA-sinjaalaktiviteit yn 'e IPR tanommen fan P1/P2 en in pyk berikte by P4, en dit patroan bleau konstant oer de tiid (Fig. 4a–f en Oanfoljende Fig. 8c–f, k). Om de romtlike organisaasje fan sellen yn 'e IPR te analysearjen mei tanimmend GA-sinjaal, hawwe wy Ler IPR-sellen boppe en oan 'e kanten fan P4 markearre neffens har ûntwikkelingslot dat 34 oeren nei de earste observaasje analysearre is, d.w.s. mear as twa plastidetiden, wêrtroch't wy IPR-sellen kinne folgje tidens de primordiumûntwikkeling fan P1/P2 oant P4. Wy brûkten trije ferskillende kleuren: giel foar dy sellen dy't yntegrearre wiene yn it primordium tichtby P4, grien foar dyjingen dy't yn 'e IPR wiene, en pears foar dyjingen dy't meidienen oan beide prosessen (Fig. 7a–c). By t0 (0 oeren) wiene 1–2 lagen fan IPR-sellen sichtber foar P4 (Fig. 7a). Lykas ferwachte, doe't dizze sellen dielden, diene se dat benammen fia it transversale dielingsflak (Figs. 7a–c). Fergelykbere resultaten waarden krigen mei Col-0 SAM (rjochte op P3, waans râne fergelykber foldt as P4 yn Ler), hoewol yn dit genotype de fold dy't foarme waard by de blomrâne de IPR-sellen rapper ferburgen (Fig. 7g-i). Sa organisearret it dielingspatroan fan IPR-sellen de sellen foarôf yn radiale rigen, lykas yn ynternodiën. De organisaasje fan radiale rigen en de lokalisaasje fan IPR-sellen tusken opienfolgjende organen suggerearje dat dizze sellen ynternodiale foargongers binne.
Hjir hawwe wy in ratiometryske GA-sinjaalbiosensor, qmRGA, ûntwikkele dy't kwantitative mapping fan GA-sinjaalaktiviteit mooglik makket dy't ûntstiet út kombineare GA- en GA-reseptorkonsintraasjes, wylst ynterferinsje mei endogene sinjaalpaden minimalisearre wurdt, wêrtroch ynformaasje oer GA-funksje op sellulêr nivo levere wurdt. Hjirfoar hawwe wy in modifisearre DELLA-proteïne, mRGA, konstruearre dy't it fermogen ferlern hat om DELLA-ynteraksjepartners te binen, mar gefoelich bliuwt foar GA-induzearre proteolyse. qmRGA reagearret op sawol eksogene as endogene feroarings yn GA-nivo's, en syn dynamyske sensoreigenskippen meitsje beoardieling fan spatiotemporele feroarings yn GA-sinjaalaktiviteit tidens ûntwikkeling mooglik. qmRGA is ek in heul fleksibel ark, om't it oanpast wurde kin oan ferskate weefsels troch de promotor te feroarjen dy't brûkt wurdt foar syn ekspresje (as nedich), en sjoen de konservearre aard fan it GA-sinjaalpad en it PFYRE-motyf oer angiospermen, is it wierskynlik oerdraachber nei oare soarten22. Yn oerienstimming hjirmei waard ek oantoand dat in lykweardige mutaasje yn it rys SLR1 DELLA-proteïne (HYY497AAA) de groeirepressoraktiviteit fan SLR1 ûnderdrukt, wylst de GA-bemiddelde degradaasje mar in bytsje fermindere, fergelykber mei mRGA23. It is opmerklik dat resinte stúdzjes yn Arabidopsis oantoand hawwe dat in inkele aminosoermutaasje yn it PFYRE-domein (S474L) de transkripsjonele aktiviteit fan RGA feroare sûnder ynfloed te hawwen op syn fermogen om te ynteraksje mei transkripsjefaktorpartners50. Hoewol dizze mutaasje tige ticht by de 3 aminosoersubstituasjes leit dy't oanwêzich binne yn mRGA, litte ús stúdzjes sjen dat dizze twa mutaasjes ûnderskate skaaimerken fan DELLA feroarje. Hoewol de measte transkripsjefaktorpartners bine oan 'e LHR1- en SAW-domeinen fan DELLA26,51, kinne guon konservearre aminosoeren yn it PFYRE-domein helpe om dizze ynteraksjes te stabilisearjen.
Internodale ûntwikkeling is in kaaikarakteristyk yn plantarsjitektuer en opbringstferbettering. qmRGA liet hegere GA-sinjaalaktiviteit sjen yn IPR-internodale foarrinnersellen. Troch kwantitative ôfbylding en genetika te kombinearjen, hawwe wy oantoand dat GA-sinjaalpatroanen sirkelfoarmige/transversale seldielingsflakken yn 'e SAM-epidermis superponearje, wêrtroch't de seldielingsorganisaasje foarme wurdt dy't nedich is foar internodale ûntwikkeling. Ferskate regulators fan seldielingsflak-oriïntaasje binne identifisearre tidens ûntwikkeling52,53. Us wurk jout in dúdlik foarbyld fan hoe't GA-sinjaalaktiviteit dizze sellulêre parameter regelet. DELLA kin ynteraksje mei foarfoldingsproteinkompleksen41, sadat GA-sinjaal de oriïntaasje fan it seldielingsflak kin regelje troch direkt ynfloed te hawwen op 'e oriïntaasje fan kortikale mikrotubuli40,41,54,55. Wy hawwe ûnferwachts oantoand dat yn SAM de korrelaat fan hegere GA-sinjaalaktiviteit net selferlinging of -dieling wie, mar allinich groeianisotropie, wat oerienkomt mei in direkt effekt fan GA op 'e rjochting fan seldieling yn 'e IPR. Wy kinne lykwols net útslute dat dit effekt ek yndirekt wêze kin, bygelyks bemiddele troch GA-induzearre selwandferweking56. Feroarings yn selwandeigenskippen feroarsaakje meganyske stress57,58, dy't ek ynfloed kin hawwe op 'e oriïntaasje fan it seldielingsflak troch ynfloed te hawwen op 'e oriïntaasje fan kortikale mikrotubuli39,46,59. De kombineare effekten fan GA-induzearre meganyske stress en direkte regeling fan mikrotubuli-oriïntaasje troch GA kinne belutsen wêze by it generearjen fan in spesifyk patroan fan seldielingsoriïntaasje yn 'e IPR om ynternodiën te definiearjen, en fierdere stúdzjes binne nedich om dit idee te testen. Op deselde wize hawwe eardere stúdzjes it belang fan 'e DELLA-ynteraksje-proteinen TCP14 en 15 yn 'e kontrôle fan ynternodifoarming60,61 markearre en dizze faktoaren kinne de aksje fan GA tegearre mei BREVIPEDICELLUS (BP) en PENNYWISE (PNY) bemiddelje, dy't de ûntwikkeling fan ynternodiën regelje en oantoand hawwe dat se ynfloed hawwe op GA-sinjalearring2,62. Mei it each op it feit dat DELLA's ynteraksje hawwe mei brassinosteroïde, etyleen, jasmonsoer en abscisinezuur (ABA) sinjaalpaden63,64 en dat dizze hormonen ynfloed hawwe kinne op 'e oriïntaasje fan mikrotubuli65, kinne de effekten fan GA op seldielingsoriïntaasje ek bemiddele wurde troch oare hormonen.
Iere cytologyske stúdzjes lieten sjen dat sawol de binnenste as de bûtenste regio's fan 'e Arabidopsis SAM nedich binne foar de ûntwikkeling fan ynternodiën2,42. It feit dat GA aktyf seldieling yn 'e binnenste weefsels12 regulearret stipet in dûbele funksje fan GA by it regeljen fan meristeem- en ynternodiëgrutte yn 'e SAM. It patroan fan rjochtingseldieling wurdt ek strak regele yn it binnenste SAM-weefsel, en dizze regeling is essensjeel foar stamgroei52. It sil nijsgjirrich wêze om te ûndersykjen oft GA ek in rol spilet by it oriïntearjen fan it seldielingsflak yn 'e binnenste SAM-organisaasje, wêrtroch't de spesifikaasje en ûntwikkeling fan ynternodiën binnen de SAM syngronisearre wurdt.
Planten waarden yn vitro groeid yn boaiem of 1x Murashige-Skoog (MS) medium (Duchefa) oanfolle mei 1% sukrose en 1% agar (Sigma) ûnder standertbetingsten (16 oeren ljocht, 22 °C), útsein foar hypokotyl- en woartelgroei-eksperiminten wêryn siedlingen waarden groeid op fertikale platen ûnder konstant ljocht en 22 °C. Foar nitraat-eksperiminten waarden planten groeid op modifisearre MS-medium (bioWORLD-plantmedium) oanfolle mei foldwaande nitraat (0 of 10 mM KNO3), 0,5 mM NH4-suksinaat, 1% sukrose en 1% A-agar (Sigma) ûnder lange-dei-betingsten.
GID1a cDNA ynfoege yn pDONR221 waard rekombinearre mei pDONR P4-P1R-pUBQ10 en pDONR P2R-P3-mCherry yn pB7m34GW om pUBQ10::GID1a-mCherry te generearjen. IDD2 DNA ynfoege yn pDONR221 waard rekombinearre yn pB7RWG266 om p35S:IDD2-RFP te generearjen. Om pGID1b::2xmTQ2-GID1b te generearjen, waarden in fragmint fan 3,9 kb stroomop fan 'e GID1b-kodearjende regio en in fragmint fan 4,7 kb mei it GID1b cDNA (1,3 kb) en de terminator (3,4 kb) earst amplifisearre mei de primers yn Oanfoljende Tabel 3 en doe ynfoege yn respektivelik pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) en pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), en úteinlik rekombinearre mei pDONR221 2xmTQ268 yn 'e pGreen 012567-doelvektor mei Gateway-kloning. Om pCUC2::LSSmOrange te generearjen, waarden de CUC2-promotorsekwinsje (3229 bp stroomop fan ATG) folge troch de kodearjende sekwinsje fan grutte Stokes-ferskowe mOrange (LSSmOrange)69 mei it N7-nukleêre lokalisaasjesignaal en de NOS-transkripsjonele terminator gearstald yn 'e pGreen kanamycine-targetingfektor mei it Gateway 3-fragment rekombinaasjesysteem (Invitrogen). De binêre fektor fan planten waard ynfierd yn Agrobacterium tumefaciens-stam GV3101 en ynfierd yn Nicotiana benthamiana-blêden troch de Agrobacterium-ynfiltraasjemetoade en yn Arabidopsis thaliana Col-0 troch de blomdipmetoade, respektivelik. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry en pCLV3::mCherry-NLS qmRGA waarden isolearre út 'e F3- en F1-neiteam fan 'e respektive krusingen, respektivelik.
RNA in situ hybridisaasje waard útfierd op sawat 1 sm lange scheutpunten72, dy't waarden sammele en fuortendaliks fiksearre yn FAA-oplossing (3,7% formaldehyde, 5% azijnzuur, 50% ethanol) foarôfkuolle oant 4 °C. Nei 2 × 15 min fakuümbehannelingen waard it fiksearmiddel feroare en waarden de samples oernachtich ynkubearre. GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2, en RGL3 cDNA's en antisense probes oan har 3'-UTR's waarden synthetisearre mei de primers werjûn yn Oanfoljende Tabel 3 lykas beskreaun troch Rosier et al.73. Digoxigenine-labelde probes waarden immunodetekteare mei digoxigenine-antistoffen (3000-fâldige ferdunning; Roche, katalogusnûmer: 11 093 274 910), en seksjes waarden kleurd mei 5-bromo-4-chloro-3-indolylfosfaat (BCIP, 250-fâldige ferdunning)/nitroblauwe tetrazolium (NBT, 200-fâldige ferdunning) oplossing.
Pleatsingstiid: 10 febrewaris 2025