It anthelmintyske medisyn N,N-diethyl-m-toluamide (DEET) is rapportearre om AChE (acetylcholinesterase) te remjen en hat potinsjele karsinogene eigenskippen fanwegen oermjittige vaskularisaasje. Yn dit artikel litte wy sjen dat DEET spesifyk endotheelzellen stimulearret dy't angiogenese befoarderje, wêrtroch tumorgroei tanimt. DEET aktivearret sellulêre prosessen dy't liede ta angiogenese, ynklusyf proliferaasje, migraasje en adhesion. Dit wurdt assosjeare mei ferhege NO-produksje en VEGF-ekspresje yn endotheelzellen. It stilmeitsjen fan M3 of it brûken fan farmakologyske M3-ynhibitoren hat al dizze effekten ôfskaft, wat suggerearret dat DEET-induzearre angiogenese M3-gefoelich is. Eksperiminten mei kalsiumsinjalearring yn endotheel- en HEK-zellen dy't M3-receptors oerekspressearje, lykas bindings- en dockingstúdzjes, jouwe oan dat DEET fungearret as in allosteryske modulator fan M3-receptors. Fierder remt DEET AChE, wêrtroch de biobeskikberens fan acetylcholine en syn binding oan M3-receptors fergruttet, en proangiogenyske effekten ferbetteret troch allosteryske regeling.
Primêre EC's waarden isolearre út 'e aorta fan Switserske mûzen. De ekstraksjemetoade waard oanpast fan it Kobayashi-protokol 26. Murine EC's waarden kultivearre yn EBM-2-medium oanfolle mei 5% waarmte-ynaktivearre FBS oant de fjirde passaazje.
It effekt fan twa konsintraasjes DEET op 'e proliferaasje fan HUVEC, U87MG, of BF16F10 waard analysearre mei de CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular Probes, C7026). Koartsein waarden 5.103 sellen per putsje siedde yn in plaat mei 96 putsjes, oernachtich oanhingje litten, en doe 24 oeren behannele mei DEET. Nei it fuortheljen fan it groeimedium, foegje in kleurstofbinende oplossing ta oan elke putsje fan 'e mikroplaat en ynkubearje de sellen 30 minuten by 37 °C. Fluoreszinsjenivo's waarden bepaald mei in Mithras LB940 multimode mikroplaatlêzer (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Dútslân) foarsjoen fan 485 nm eksitaasjefilters en 530 nm emisjefilters.
HUVEC waarden siedde yn platen mei 96 putten mei in tichtens fan 104 sellen per putsje. Sellen waarden 24 oeren behannele mei DEET. Sellibensfetberens waard beoardiele mei in kolorimetryske MTT-assay (Sigma-Aldrich, M5655). Optyske tichtheidswearden waarden krigen op in multimode mikroplaatlêzer (Mithras LB940) by in golflingte fan 570 nm.
De effekten fan DEET waarden bestudearre mei in vitro angiogenese-assays. Behanneling mei 10-8 M of 10-5 M DEET fergrutte de foarming fan kapillêre lingte yn HUVEC's (Fig. 1a, b, wite balken). Yn ferliking mei de kontrôlegroep liet behanneling mei DEET-konsintraasjes fariearjend fan 10-14 oant 10-5 M sjen dat de kapillêre lingte in plateau berikte by 10-8 M DEET (Oanfoljende Fig. S2). Der waard gjin signifikant ferskil fûn yn it in vitro proangiogenyske effekt fan HUVEC's behannele mei DEET yn it konsintraasjeberik fan 10-8 M en 10-5 M.
Om it effekt fan DEET op neovaskularisaasje te bepalen, hawwe wy in vivo neovaskularisaasjestúdzjes útfierd. Nei 14 dagen lieten mûzen dy't ynjeksjeare waarden mei endotheelzellen dy't foarkultivearre wiene mei 10-8 M of 10-5 M DEET in wichtige tanimming fan hemoglobine-ynhâld sjen (Fig. 1c, wite balken).
Fierder waard DEET-induzearre neovaskularisaasje bestudearre yn U87MG-xenograft-dragende mûzen dy't deistich (ip) ynjeksjeare waarden mei DEET yn in doasis dy't bekend is om plasmakonsintraasjes fan 10-5 M te indusearjen, wat normaal is by bleatstelde minsken. yn 23. Detektearbere tumors (d.w.s. tumors >100 mm3) waarden 14 dagen nei ynjeksje fan U87MG-sellen yn mûzen waarnommen. Op dei 28 wie de tumorgroei signifikant fersterke yn DEET-behannele mûzen yn ferliking mei kontrôlemûzen (Fig. 1d, fjouwerkanten). Fierder liet CD31-kleuring fan tumors sjen dat DEET it kapillêrgebiet signifikant fergrutte, mar net de tichtens fan mikrofet. (Fig. 1e-g).
Om de rol fan muskarinereceptors yn DETA-induzearre proliferaasje te bepalen, waard 10-8 M of 10-5 M DETA yn oanwêzigens fan pFHHSiD (10-7 M, in selektive M3-receptorantagonist) brûkt. Behanneling fan HUVEC. pFHHSiD blokkearre de proliferative eigenskippen fan DETA folslein by alle konsintraasjes (Tabel 1).
Under dizze omstannichheden hawwe wy ek ûndersocht oft DEET de kapillêre lingte yn HUVEC-sellen soe ferheegje. Op deselde wize foarkaam pFHHSiD signifikant DEET-induzearre kapillêre lingte (Fig. 1a, b, grize balken). Fierder waarden ferlykbere eksperiminten útfierd mei M3 siRNA. Hoewol de kontrôle siRNA net effektyf wie yn it befoarderjen fan kapillêre foarming, makke it stillizzen fan 'e M3 muskarinereceptor it fermogen fan DEET om de kapillêre lingte te ferheegjen ôf (Fig. 1a, b, swarte balken).
Fierder waarden sawol 10-8 M as 10-5 M DEET-induzearre vaskularisaasje yn vitro as neovaskularisaasje yn vivo folslein blokkearre troch pFHHSiD (Fig. 1c, d, sirkels). Dizze resultaten jouwe oan dat DEET angiogenese befoarderet fia in paad dat gefoelich is foar selektive M3-reseptorantagonisten of M3 siRNA.
AChE is it molekulêre doelwyt fan DEET. Medisinen lykas donepezil, dy't fungearje as AChE-ynhibitoren, kinne EC-angiogenese yn vitro en yn mûs-efterpoot-ischemymodellen stimulearje14. Wy hawwe it effekt fan twa konsintraasjes DEET op AChE-enzymaktiviteit yn HUVEC testen. Lege (10-8 M) en hege (10-5 M) konsintraasjes fan DEET fermindere endotheliale AChE-aktiviteit yn ferliking mei kontrôlebetingsten (Fig. 2).
Beide konsintraasjes fan DEET (10-8 M en 10-5 M) fermindere de acetylcholinesterase-aktiviteit op HUVEC. BW284c51 (10-5 M) waard brûkt as kontrôle foar acetylcholinesterase-ynhibitoren. Resultaten wurde útdrukt as persintaazje fan AChE-aktiviteit op HUVEC behannele mei de twa konsintraasjes fan DEET yn ferliking mei sellen behannele mei in placebo. Wearden wurde útdrukt as gemiddelde ± SEM fan seis ûnôfhinklike eksperiminten. *p < 0,05 yn ferliking mei kontrôle (Kruskal-Wallis en Dunn meardere fergelikingstest).
Stikstofmonokside (NO) is belutsen by it angiogene proses 33, dêrom waard NO-produksje yn DEET-stimulearre HUVEC's bestudearre. DEET-behannele endotheliale NO-produksje wie ferhege yn ferliking mei kontrôlesellen, mar berikte allinich betsjutting by in doasis fan 10-8 M (Fig. 3c). Om de molekulêre feroarings te bepalen dy't DEET-induzearre NO-produksje kontrolearje, waarden eNOS-ekspresje en aktivearring analysearre troch Western blotting. Hoewol DEET-behanneling de eNOS-ekspresje net feroare, fergrutte it de eNOS-fosforylaasje signifikant op syn aktivearjende plak (Ser-1177), wylst it syn remmende plak (Thr-495) fermindere yn ferliking mei net-behannele sellen yn eNOS-fosforylaasje (Fig. 3d). Fierder waard de ferhâlding fan fosforylearre eNOS op it aktivearjende plak en remmende plak berekkene nei it normalisearjen fan de hoemannichte fosforylearre eNOS ta de totale hoemannichte enzyme. Dizze ferhâlding wie signifikant ferhege yn HUVEC's behannele mei elke konsintraasje fan DEET yn ferliking mei net-behannele sellen (Fig. 3d).
Uteinlik waard de ekspresje fan VEGF, ien fan 'e wichtichste proangiogenyske faktoaren, analysearre troch Western blotting. DEET fergrutte de VEGF-ekspresje signifikant, wylst pFHHSiD dizze ekspresje folslein blokkearre.
Omdat de effekten fan DEET gefoelich binne foar sawol farmakologyske blokkade as delregulearring fan M3-receptors, hawwe wy de hypoteze hifke dat DEET kalsiumsinjalearring miskien ferbetterje kin. Ferrassenderwize slagge DEET der net yn om cytoplasmatysk kalsium yn HUVEC (gegevens net werjûn) en HEK/M3 (Fig. 4a, b) te ferheegjen foar beide brûkte konsintraasjes.
Pleatsingstiid: 30 desimber 2024