De anthelmintyske drug N,N-diethyl-m-toluamide (DEET) is rapportearre om AChE (acetylcholinesterase) te inhibitearjen en hat potinsjele karzinogenyske eigenskippen troch oermjittige vascularisaasje. Yn dit papier litte wy sjen dat DEET spesifyk stimulearret endotheliale sellen dy't angiogenesis befoarderje, en dêrmei tumorgroei ferheegje. DEET aktivearret sellulêre prosessen dy't liede ta angiogenesis, ynklusyf proliferaasje, migraasje en adhesion. Dit is ferbûn mei ferhege NO-produksje en VEGF-ekspresje yn endotheliale sellen. Silencing fan M3 of it brûken fan farmakologyske M3-ynhibitoren ôfskaft al dizze effekten, wat suggerearret dat DEET-induzearre angiogenesis M3-gefoelich is. Eksperiminten wêrby't kalsiumsignalearring yn endotheliale en HEK-sellen oerekspresje fan M3-receptors, lykas bindings- en dockingstúdzjes, jouwe oan dat DEET fungearret as in allosteryske modulator fan M3-receptors. Fierder ynhibeart DEET AChE, wêrtroch de biobeskikberens fan acetylcholine en syn bining oan M3-receptors ferheget, en proangiogenyske effekten fersterkje troch allosteryske regeling.
Primêre EC's waarden isolearre fan 'e aorta fan Switserske mûzen. De ekstraksjemetoade waard oanpast fan it Kobayashi-protokol 26. Murine EC's waarden kultivearre yn EBM-2 medium oanfolle mei 5% waarmte-ynaktivearre FBS oant de fjirde passaazje.
It effekt fan twa konsintraasjes fan DEET op 'e proliferaasje fan HUVEC, U87MG, of BF16F10 waard analysearre mei de CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular Probes, C7026). Koartsein, 5.103 sellen per put waarden sied yn in 96-well plaat, tastien om te heakjen oernacht, en dan behannele mei DEET foar 24 h. Nei it fuortheljen fan it groeimedium, foegje kleurferbinende oplossing ta oan elke put fan 'e mikroplaat en ynkubearje de sellen by 37 ° C foar 30 min. Fluoreszinsjenivo's waarden bepaald mei in Mithras LB940 multimode mikroplatelêzer (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Dútslân) foarsjoen fan 485 nm eksitaasjefilters en 530 nm emisjefilters.
HUVEC waarden sied yn 96-well platen by in tichtens fan 104 sellen per put. Sellen waarden behannele mei DEET foar 24 oeren. Sels libbensfetberens waard beoardiele mei in kolorimetryske MTT-assay (Sigma-Aldrich, M5655). Optyske tichtenswearden waarden krigen op in multimode mikroplaatlêzer (Mithras LB940) op in golflingte fan 570 nm.
De effekten fan DEET waarden studearre mei in vitro angiogenesis-assays. Behanneling mei 10-8 M of 10-5 M DEET fergrutte de formaasje fan kapillêre lingte yn HUVEC's (Fig. 1a, b, wite balken). Yn ferliking mei de kontrôtgroep hat behanneling mei DEET-konsintraasjes fan 10-14 oant 10-5 M sjen litten dat de kapillêre lingte in plato berikte op 10-8 M DEET (Supplementary Fig. S2). Gjin signifikant ferskil waard fûn yn it in vitro proangiogene effekt fan HUVEC's behannele mei DEET yn it konsintraasjeberik fan 10-8 M en 10-5 M.
Om it effekt fan DEET op neovaskularisaasje te bepalen, hawwe wy in vivo neovaskularisaasjestúdzjes útfierd. Nei 14 dagen, mûzen ynjeksje mei endotheliale sellen precultured mei 10-8 M of 10-5 M DEET toande in signifikante ferheging fan hemoglobine ynhâld (Fig. 1c, wite balken).
Fierder waard DEET-induzearre neovaskularisaasje studearre yn U87MG xenograft-dragende mûzen dy't deistich (ip) mei DEET ynjeksje waarden yn in doasis dy't bekend is om plasmakonsintraasjes fan 10-5 M te inducearjen, wat normaal is yn bleatstelde minsken. yn 23. Detectable tumors (ie tumors> 100 mm3) waarden waarnommen 14 dagen nei ynjeksje fan U87MG sellen yn mûzen. Op dei 28 waard tumorgroei signifikant fersterke yn DEET-behannele mûzen yn ferliking mei kontrôlemûzen (Fig. 1d, kwadraten). Fierder liet CD31-kleuring fan tumors sjen dat DEET it kapillêre gebiet signifikant fergrutte mar net de tichtens fan mikrovessel. (Fig. 1e–g).
Om de rol fan muskarine-receptors yn DETA-induzearre proliferaasje te bepalen, waard 10-8 M of 10-5 M DETA yn 'e oanwêzigens fan pFHHSiD (10-7 M, in selektive M3-receptorantagonist) brûkt. Behanneling fan HUVEC. pFHHSiD blokkearre folslein de proliferative eigenskippen fan DETA by alle konsintraasjes (tabel 1).
Under dizze betingsten ûndersochten wy ek oft DEET de kapillêre lingte soe fergrutsje yn HUVEC-sellen. Lykas foarkaam pFHHSiD signifikant DEET-induzearre kapillêre lingte (Fig. 1a, b, grize balken). Fierder waarden ferlykbere eksperiminten útfierd mei M3 siRNA. Hoewol't de kontrôle siRNA net effektyf wie yn it befoarderjen fan kapillêre formaasje, it stiljen fan 'e M3 muscarinyske receptor ôfskaft it fermogen fan DEET om kapillêre lingte te fergrutsjen (Fig. 1a, b, swarte balken).
Fierder waarden sawol 10-8 M as 10-5 M DEET-induzearre vascularisaasje yn vitro en neovaskularisaasje yn vivo folslein blokkearre troch pFHHSiD (Fig. 1c, d, sirkels). Dizze resultaten jouwe oan dat DEET angiogenesis befoarderet fia in paad dat gefoelich is foar selektive M3-receptorantagonisten as M3 siRNA.
AChE is it molekulêre doel fan DEET. Drugs lykas donepezil, dy't fungearje as AChE-ynhibitoren, kinne EC-angiogenese stimulearje yn vitro en yn mûs hindlimb ischemia-modellen14. Wy testen it effekt fan twa konsintraasjes fan DEET op AChE-enzymeaktiviteit yn HUVEC. Lege (10-8 M) en hege (10-5 M) konsintraasjes fan DEET fermindere endotheliale AChE-aktiviteit yn ferliking mei kontrôlebetingsten (fig. 2).
Beide konsintraasjes fan DEET (10-8 M en 10-5 M) fermindere acetylcholinesterase-aktiviteit op HUVEC. BW284c51 (10-5 M) waard brûkt as kontrôle foar acetylcholinesterase-ynhibitoren. Resultaten wurde útdrukt as persintaazje fan AChE-aktiviteit op HUVEC behannele mei de twa konsintraasjes fan DEET fergelike mei auto-behannele sellen. Wearden wurde útdrukt as gemiddelde ± SEM fan seis ûnôfhinklike eksperiminten. *p <0.05 fergelike mei kontrôle (Kruskal-Wallis en Dunn meardere fergelikingstest).
Stikstofoxide (NO) is belutsen by it angiogene proses 33, dêrom waard NO produksje yn DEET-stimulearre HUVEC's studearre. DEET-behannele endotheliale NO-produksje waard ferhege yn ferliking mei kontrôlesellen, mar berikte betsjutting allinich by in doasis fan 10-8 M (fig. 3c). Om de molekulêre feroaringen te bepalen dy't DEET-induzearre NO-produksje kontrolearje, waarden eNOS-ekspresje en aktivearring analysearre troch Western blotting. Hoewol't DEET-behanneling de eNOS-ekspresje net feroare, fergrutte it eNOS-fosforylaasje signifikant op har aktivearjende side (Ser-1177) wylst syn remmende side (Thr-495) fermindere yn ferliking mei net behannele sellen yn eNOS-fosforylaasje (Fig. 3d). Fierder waard de ferhâlding fan phosphorylearre eNOS op 'e aktivearringside en remmende side berekkene nei it normalisearjen fan it bedrach fan phosphorylearre eNOS nei it totale bedrach fan enzyme. Dizze ferhâlding waard signifikant ferhege yn HUVEC's behannele mei elke konsintraasje fan DEET yn ferliking mei net behannele sellen (Fig. 3d).
Uteinlik waard de ekspresje fan VEGF, ien fan 'e wichtichste proangiogenyske faktoaren, analysearre troch Western blotting. DEET fergrutte de VEGF-ekspresje signifikant, wylst pFHHSiD dizze ekspresje folslein blokkearre.
Om't de effekten fan DEET gefoelich binne foar sawol farmakologyske blokkade as downregulaasje fan M3-receptors, testen wy de hypoteze dat DEET kalsiumsinjalearring kin ferbetterje. Ferrassend, DEET mislearre cytoplasmyske kalzium yn HUVEC (gegevens net te sjen) en HEK / M3 (Fig. 4a, b) foar beide konsintraasjes brûkt.
Post tiid: Dec-30-2024