Bestridingsmiddels spylje in krúsjale rol by it oanpakken fan wrâldwide fiedseltekoarten en it bestriden fan troch fektors oerdroegen minsklike sykten. It groeiende probleem fan bestridingsmiddelsresistinsje fereasket lykwols driuwend de ûntdekking fan nije ferbiningen dy't rjochte binne op ûnderbenutte doelen. Ynsektentransiente reseptorpotinsjeel (TRPV) kanalen - Nanzhong (Nan) en ynaktyf (Iav) - kinne heterologe kanalen (Nan-Iav) foarmje en lokalisearje nei mechanosensoryske organen dy't geotropisme, gehoar en propriosepsje yn ynsekten bemiddelje. Guon bestridingsmiddels, lykas aphidopyrrolidon (AP), rjochtsje har op Nan-Iav fia ûnbekende meganismen. AP is effektyf tsjin piercing-suigjende ynsekten (hemipterans), en foarkomt it fieden troch de funksje fan 'e filamenten te fersteuren. AP kin allinich bine oan Nan, mar allinich Nan-Iav kin ynteraksje mei agonisten, ynklusyf endogene nicotinamide (NAM), en dêrmei kanaalaktiviteit sjen litte. Nettsjinsteande it potensjeel fan Nan-Iav as in ynsektiziddoel, is der net folle bekend oer syn kanaalassemblaazje, regeljouwende bindingsplakken en Ca2+-ôfhinklike regeling, wat fierdere ûntwikkeling fan ynsektiziden hinderet. Yn dizze stúdzje waard kryo-elektronenmikroskopie brûkt om de struktuer fan Nan-Iav yn Hemiptera-ynsekten te bepalen yn 'e kalmoduline-ligandfrije steat, lykas mei AP en NAM oan 'e grins fan it ankyrin-repeat cytoplasmatysk domein (ARD). Ferrassend genôch fûnen wy dat it Nan-proteïne sels in pentameer kin foarmje, dat stabilisearre wurdt troch AP-bemiddelde ARD-ynteraksjes. Dizze stúdzje lit molekulêre ynteraksjes sjen tusken ynsektisiden en agonisten en Nan-Iav, en beklammet it belang fan ARD yn kanaalfunksje en gearstalling, en ûndersiket it meganisme fan Ca2+-regeling.
Tsjin de eftergrûn fan hieltyd slimmer wrâldwide klimaatferoaring is it efterútgean fan 'e wrâldwide fiedingsfeiligens ien fan 'e grutste útdagings fan 'e 21e iuw, mei kaskadearjende gefolgen foar de maatskippij.1,2It rapport fan 'e Wrâldsûnensorganisaasje oer de steat fan fiedingsfeiligens en fieding yn 'e wrâld 2023 (SOFI) skat dat sawat 2,33 miljard minsken wrâldwiid lije oan matige oant swiere fiedingsûnfeiligens, in lang besteand probleem.3,4Spitigernôch giet nei skatting 20% oant 30% of mear fan 'e gewaaksopbringsten jierliks ferlern oan pleagen en patogenen, en wurdt ferwachte dat de wrâldwide opwaarming de wjerstân tsjin pleagen en de kwetsberens fan gewaaksen sil fergrutsje.4,5,6,7,8De ûntwikkeling fan bestridingsmiddels is kritysk, net allinich om gewaaksen te beskermjen tsjin pleagen en de fersprieding fan troch vektors oerdroegen patogenen te ferminderjen, mar ek om troch vektors oerdroegen minsklike sykten lykas denguekoarts, malaria en de sykte fan Chagas te bestriden, dy't hieltyd mear resistint binne foar bestridingsmiddels.5,9,10,11
Under de wichtichste doelen fan neurotoksyske ynsektisiden fertsjintwurdiget it heterotetramere TRPV-kanaal Nanchung (Nan)-Inactive (Iav) in klasse fan ynsektisidendoelen dy't pas yn it lêste desennium ûntdutsen binne, ynklusyf kommersjeel beskikbere ynsektisiden lykas imidakloprid en pyraclostrobine.12,13,14It semi-syntetyske ynsektisid aphidopyrrolifen (AP) is in koartlyn ûntwikkele en kommersjalisearre produkt waans haadkomponint it aktive ynsektisid Inscalis® is, dat AP bindt op in subnanomolêr aktiviteitsnivo.15AP fertoant lege akute toksisiteit foar bestuivers, foardielige ynsekten en oare net-doelorganismen, en as it brûkt wurdt neffens de ynstruksjes op it etiket, kin it de wjerstânsdruk tsjin oare ynsektisiden ferminderje.16,17,18Nan en Iav binne wiidferspraat oer ynsektensoarten, wurde allinich mei-útdrukt yn koardale stretch-receptorneuronen fan 'e antennes en ledematen, en binne kritysk foar hearren, swiertekrêftpersepsje en propriosepsje.13,16,19,20,21,22AP, imidakloprid, en pyraclostrobine stimulearje it Nan-Iav-kompleks fia in unyk meganisme, wêrtroch úteinlik proprioseptive sinjaaltransduksje remt.13,16,23By piercing-sûgjende ynsekten (hemipteranen) lykas bladluzen en wite miggen, beheindet ferlies fan propriosepsje har fiedfermogen, wat úteinlik liedt ta de dea.13,24Nijsgjirrich is dat AP in hege affiniteit foar it Nan-Iav-kompleks en in lege affiniteit foar allinnich Nan sjen lit. Binding fan AP oan Nan-Iav feroarsaket in elektryske stroom, mar binding oan allinnich Nan stimulearret gjin kanaalaktiviteit. Iav sels bindt hielendal net oan AP.16Dit suggerearret dat Nan en Iav kinne bine om ferskillende Nan-Iav-kanaalkompleksen te foarmjen (bygelyks, mei ferskillende stoichiometryske ferhâldingen of ferskillende arranzjeminten binnen deselde stoichiometryske ferhâlding) of dat AP kin bine oan meardere plakken. Fierder bindt de natuerlike agonist nicotinamide (NAM) oan Drosophila Nan-Iav mei mikromolêre affiniteit, en toant effekten dy't fergelykber binne mei dy fan bladluzen (AP) yn vitro.16,25en it remmen fan bladluzenreproduksje en fieding, wat úteinlik liedt ta har dea25,26Dizze gegevens roppe in protte fragen op. Bygelyks, it bliuwt ûndúdlik hoe't de Nan-Iav heterodimeer foarme wurdt, hokker bindingsplakken brûkt wurde om lytse molekulen te modulearjen, en hoe't dizze lytse molekulen de kanaalfunksje regelje troch propriosepsje te ûnderdrukken. Fierder bliuwe de redenen wêrom't Nan sels ynaktyf is en in lege affiniteit hat foar AP, wylst de Nan-Iav heterodimeer aktyf is en AP mei hegere affiniteit bindt, ûndúdlik. Uteinlik is der net folle bekend oer de Ca2+-ôfhinklike regeling fan Nan-Iav-funksje en hoe't it yntegrearre is yn neuronale sinjaalprosessen.. 13,21
Yn dizze stúdzje, wêrby't wy kryo-elektronenmikroskopie, elektrofysiology en radioligandbindingstechniken kombinearre hawwe, hawwe wy de gearstalling fan Nan-Iav en it meganisme fan syn binding oan lytse molekuleregulators ferdúdlike. Fierder hawwe wy konstitutyf bûn kalmoduline (CaM) oan Iav en AP-stabilisearre Nan-pentameren ûntdutsen. Dizze resultaten jouwe wichtige ynsjoggen yn 'e regeling fan kalsiumionen yn kanalen, kanaalgearstalling en de faktoaren dy't ligandbindingsaffiniteit bepale. Wichtiger is dat wy befêstige hawwe dat ARD in sintrale rol spilet yn dizze prosessen. Us stúdzje fan folsleine ynsektenkanalen bûn oan relevante lânboubestridingsmiddels.27, 28, 29iepenet perspektiven foar de ûntwikkeling fan 'e bestridingsmiddelsyndustry, ferbetteret de effektiviteit en spesifisiteit fan bestridingsmiddels, en makket de tapassing fan TRPV-rjochte ferbiningen op oare soarten mooglik om wrâldwide fiedingsfeiligens en de fersprieding fan troch fektoren oerdroegen sykten oan te pakken.
Wy hawwe ek fûn dat Nan-Iav regele wurdt troch Ca2+, en it meganisme fan regeling wurdt bemiddele troch konstitutyf bûn CaM. Wichtich is dat dizze Ca2+-ôfhinklike regeling fan Nav troch CaM signifikant ferskilt fan 'e meganismen fan regeling fan oare ionkanalen (bygelyks spanningsôfhinklike Na+-kanalen en TRPV5/6-kanalen).52,53,54,55,56,57Yn it Nav1.2-kanaal assosjearret it C-terminale domein fan CaM helikaal mei it C-terminale domein (CTD), en Ca2+ ynducearret binding fan syn N-terminale domein oan it distale diel fan 'e CTD.56Yn it TRPV5/6-kanaal bindt it C-terminale domein fan CaM oan CTH, en Ca2+ feroarsaket opwaartse útwreiding fan syn N-terminale domein yn 'e poar, wêrtroch't de katioanpermeabiliteit blokkearre wurdt.53,54Wy stelle in model foar foar de Ca2+-regulearre funksje fan Nan-Iav-CaM (Fig. 4h). Yn dit model bindt it N-terminale domein fan CaM konstitutyf oan it C-terminale domein (CTH) fan Iav. Yn 'e rêststeat (lege [Ca2+]-konsintraasje) ynteraksjeart it C-terminale domein fan CaM mei Nan, wêrtroch't de ARD-konformaasje stabilisearre wurdt en dêrmei de kanaaliepening befoardere wurdt. Bining fan in agonist/ynsektizid oan it kanaal feroarsaket poareiepening, wat liedt ta Ca2+-ynstream. Ca2+ bindt dan oan CaM, wêrtroch't dissosiaasje fan it C-terminale domein fan 'e ARD fan Nan ûntstiet. Omdat it blokkearjen fan CaM-bining yn essinsje it remmende effekt fan Ca2+ ôfskaft, modulearret dizze dissosiaasje de ARD-mobiliteit, wêrtroch't Ca2+-ôfhinklike ynhibysje of desensibilisaasje ûntstiet. It rappe herstel fan kanaalstreamen nei kalsiumioneluasje (Fig. 4g) suggerearret dat dit meganisme rappe reaksjes op Ca2+-mediearre neuronale sinjalen fasilitearret. Fierder is rapportearre dat de C-terminale regio fan Iav, dy't noch altyd min begrepen wurdt, oare rollen spilet yn kanaaltargeting en hjoeddeistige regeljouwing.21
Uteinlik presintearret ús stúdzje de hege-resolúsje struktuer fan in ynsektizid-ynsektizid TRP-kanaalkompleks fan agrarysk belang - in ûntdekking dy't earder ûnbekend wie foar ús. It is wichtich om te notearjen dat wy de struktuer en funksje fan it ynsektenkanaal yn minsklike sellen (HEK293S GnTi–) karakterisearre hawwe ynstee fan ynsektenzellen. Mei it each op tanimmende ynsektizidresistinsje en oanhâldende druk op fiedingsfeiligens en patogenen, leveret ús wurk wichtige ynformaasje dy't de ûntwikkeling fan nije ynsektisiden sil fasilitearje foar it foardiel fan minsklike sûnens en wrâldwide fiedingsfeiligens. Undersyk hat oantoand dat ynsektisiden lykas AP effektyf binne tsjin guon pleagen as se brûkt wurde neffens de ynstruksjes op it etiket en in lege akute toksisiteit hawwe foar foardielige bestuivers, wat har miljeufeiligens oantoant.13,16Fierder hat testen fan guon AP-derivaten op muggen oantoand dat se úteinlik har fermogen om te fleanen ferlieze. Begrip fan hoe't dizze modulerende ferbiningen bine oan Nan-Iav sil de modifikaasje fan besteande ferbiningen of de ûntwikkeling fan nije ferbiningen foar effektiver en makliker meitsje.presyspestkontrôle. Us stúdzje lit sjen dat de Nan-Iav ARD-ynterface kritysk is, net allinich foar it regeljen fan 'e aktiviteit fan endogene ferbiningen, bestridingsmiddels en Ca2+-CaM, mar ek foar kanaalassemblaasje. Wy suggerearje dat it ûnderbrekken fan heterodimeerassemblaasje mei lytse molekulen in unike en beloftefolle oanpak kin wêze foar it ûntwikkeljen fan ionkanaalremmers.
Fan 'e acht ortologe genen waarden de folsleine genen fan 'e brune kever (Halyomorpha halys) Nanchung en Inactive selektearre, dy't poerbêste stabiliteit yn detergenten sjen lieten. De synthetisearre genen waarden kodon-optimalisearre foar minsklike ekspresje en klonearre yn 'e pBacMam pCMV-DEST-fektor (Life Technologies) mei XhoI- en EcoRI-restriksjeplakken. Dit soarge derfoar dat de klonen yn frame wiene mei de C-terminale GFP-FLAG-10xHis- en mCherry-FLAG-10xHis-tags, dy't spjalte wurde troch HRC-3C-protease (PPX), wêrtroch ûnôfhinklike ...útdrukkingDe primers dy't brûkt waarden om Nanchung en Inactive yn 'e pBacMam-fektor te klonen wiene as folget:
Mikroskopyske ôfbyldings fan yndividuele dieltsjes waarden krigen op in Titan Krios G2 transmissie-elektronenmikroskoop (FEI) foarsjoen fan in K3-kamera en in Gatan BioQuantum-enerzjyfilter. De mikroskoop waard betsjinne op 300 keV, mei in enerzjy-ynstelling fan 20 eV, in stekproefpikselgrutte fan 1,08 Å/piksel (nominale fergrutting fan 81.000x), en in defokusgradiënt fariearjend fan -0,8 oant -2,2 μm. Fideo-opname waard útfierd op 40 frames per sekonde mei in Latitude S-mikroskoop (Gatan) mei in nominale dosisrate fan 25 e–px−1 s−1, in eksposysjetiid fan 2,4 s, en in totale dosis fan sawat 60 e–Å−2.
Beam-induzearre bewegingskorreksje en dosisgewichting waarden útfierd op film mei MotionCor2 yn RELION 4.061. Kontrast-oerdrachtfunksje (CTF) parameterskatting waard útfierd yn cryoSPARC mei de patch-basearre CTF-skattingsmetoade62. Fotomikrografyen mei in CTF-oanpassingsresolúsje ≥4 Å waarden útsletten fan folgjende analyze. Typysk waard in subset fan 500–1000 fotomikrografyen brûkt foar puntseleksje yn cryoSPARC, folge troch ferskate rûndes fan 2D-klassifikaasje nei filterjen om in dúdlike referinsjeôfbylding te krijen foar sjabloan-basearre dieltsjeseleksje. Dieltsjes waarden doe ekstrahearre mei 64-piksel grinzende doazen en 4-fâldige binning. Ferskate rûndes fan 2D-klassifikaasje waarden útfierd om net-winske dieltsjeskategoryen te ferwiderjen. It earste 3D-model waard rekonstruearre mei ab initio-rekonstruksje en ferfine mei net-uniforme ferfining yn cryoSPARC. 3D-klassifikaasje waard útfierd yn cryoSPARC of RELION basearre op ARD-heterogeniteit. Gjin wichtige heterogeniteit fan membraandomeinen waard waarnommen. Dieltsjes waarden ferfine mei de C1- en C2-metoaden; Partikels mei hegere C2-resolúsje waarden as symmetrysk beskôge mei respekt foar C2 en ymportearre yn RELION foar Bayesiaanske ferfining. De dieltsjes waarden doe werom oerbrocht nei cryoSPARC foar definitive net-uniforme en lokale ferfining. De definitive resolúsje en dieltsjetellingen wurde werjûn yn tabel 1.
By it ferwurkjen fan Nan+AP-pentameren hawwe wy ferskate metoaden ûndersocht foar it ferbetterjen fan de resolúsje fan membraandomeinen (benammen it poarregio), lykas sinjaal-subtraksje en TMD-maskering. Dizze pogingen wiene lykwols net suksesfol fanwegen de potinsjeel ekstreme wanorde yn it poarregio en de algemiene heterogeniteit fan 'e TMD. De definitive resolúsje waard berekkene mei in masker dat automatysk generearre waard troch de net-uniforme ferwurkingsmetoade yn cryoSPARC, benammen rjochte op it ARD-regio. Dit berikte in signifikant hegere resolúsje as dy fan 'e membraandomeinen (benammen it VSLD-regio).
Inisjele de novo-modellen fan 'e apo-foarmen fan 'e Nanchung- en Inactive-bugs waarden earst generearre mei Coot63, en modellen fan 'e Nan- en Iav-bugs waarden generearre mei AlphaFold264 om regio's mei leech fertrouwen te identifisearjen. Calmodulin-modellering wie basearre op rigide-lichem-fits fan 'e Ca2+-binende en Ca2+-frije modellen yn PDB-tagongsrjochten 4JPZ56 en 1CFD65, respektivelik. De modellen waarden ferfine mei sferyske ferfining om de juste stereochemy en goede geometry te garandearjen. Fosfatidylcholine, fosfatidylethanolamine en fosfatidylserine waarden doe modellearre as goed definieare lipidedichtheden, en de NAM- en AP-liganden waarden pleatst yn 'e oerienkommende tichtheden yn 'e tight junctions. Beperkingsbestannen waarden generearre út 'e SMILES-string fan 'e isoformen mei eLBOW yn PHENIX66. Uteinlik waarden de modellen yn echte romte ferfine yn PHENIX mei lokale rastersykjen en globale minimalisaasje mei sekundêre struktuerbeperkingen. De MolProbity-tsjinner waard brûkt foar modelferfining en strukturele analyze, en yllustraasjes waarden útfierd mei PyMOL en UCSF Chimera X. 67,68,69 Aperture-analyze waard útfierd mei de HOLE-tsjinner,70 en sekwinsjebehâldmapping waard útfierd mei de Consurf-tsjinner.71
Statistyske analyze waard útfierd mei Igor Pro 6.2, Excel Office 365, en GraphPad Prism 7.0. Alle kwantitative gegevens wurde presintearre as gemiddelde ± standertflater (SEM). Student's t-test (twasidig, net-pear) waard brûkt om twa groepen te fergelykjen. Ienwegs fariânsjeanalyse (ANOVA) folge troch Dunnett's post hoc-test waard brûkt om meardere groepen te fergelykjen. *P< 0,05, **P< 0.01, en ***P< 0.001 waarden as statistysk signifikant beskôge ôfhinklik fan 'e gegevensferdieling. Kd-, Ki-wearden en har asymmetryske 95% fertrouwensyntervallen waarden berekkene mei GraphPad Prism 10.
Foar mear details oer de stúdzjemetodyk, sjoch de gearfetting fan it Natuerportfoliorapport dy't keppele is yn dit artikel.
It earste model waard boud mei de kalmodulinemodellen út 'e PDB 4JPZ- en 1CFD-databases. De koördinaten binne opslein yn 'e Protein Data Bank (PDB) ûnder tagongsnûmers 9NVN (Nan-Iav-CaM sûnder ligand), 9NVO (Nan-Iav-CaM bûn oan nikotinamide), 9NVP (Nan-Iav-CaM bûn oan nikotinamide en EDTA), 9NVQ (Nan-Iav-CaM bûn oan aphenidolpyrrolline en kalsium), 9NVR (Nan-Iav-CaM bûn oan aphenidolpyrrolline en EDTA), en 9NVS (Nan-pentamer bûn oan aphenidolpyrrolline). De oerienkommende kryo-elektronenmikroskopie-ôfbyldings binne opslein yn 'e Elektronenmikroskopiedatabase (EMDB) ûnder de folgjende tagongsnûmers: EMD-49844 (Nan-Iav-CaM sûnder ligand), EMD-49845 (Nan-Iav-CaM-kompleks mei nikotinamide), EMD-49846 (Nan-Iav-CaM-kompleks mei nikotinamide en EDTA), EMD-49847 (Nan-Iav-CaM-kompleks mei aphidopyrrolline en kalsium), EMD-49848 (Nan-Iav-CaM-kompleks mei aphidopyrrolline en EDTA), en EMD-49849 (Nan-pentamerkompleks mei aphidopyrrolline). De rûge gegevens foar de funksjonele analyze wurde yn dit artikel presintearre.
Pleatsingstiid: 28 jannewaris 2026